[0088] 4)重构胚的体外培养
[0089] 将已平衡好的重构胚胎移入到PZM3培养液中，置于三气培养箱中培养至胚胎移 植；
[0090] 6)将重构胚移植到自然发情的代孕母猪内继续发育，代孕母猪妊娠114天后获得 转Leptin基因的克隆仔猪；
[0091] 第四步、转L印tin基因克隆仔猪的过量表达验证
[0092] 利用设计好的GFP引物和Leptin引物对转Leptin克隆仔猪的DNA和RNA进行验 证。
[0093] 本发明实施例1可建立克隆猪动物模型进行与L印tin基因功能相关的研究，以研 究L印tin基因的表达量为切入点，通过体外构建L印tin基因过量表达载体，利用体细胞核 移植克隆转基因技术，成功实现了L印tin基因在猪体内的过量表达，用该种方法建立的动 物模型为研究人类Leptin基因的表达调控提供了重要的参考以及和应用前景；本发明中 选取猪作为L印tin基因过量表达的研究对象，而猪在体型大小、解剖结构、生理生化上与 人极为相似，这就为人类L印tin基因功能所调控的疾病研究奠定了基础，对于由L印tin基 因表达调控所建立的动物模型在人类相关疾病的治疗中的推广应用具有重要的指导意义。
[0094] 实施例2 :
[0095] -种构建过量表达Leptin克隆猪的方法，具体操作步骤的实施例如下：
[0096] 第一步，构建Leptin基因过量表达载体
[0097] 1)采用PCR法扩增目的L印tin基因
[0098] PCR扩增体系：
[0099] Loplin-F (GGC CCC AGA AGC ACA TCC) 2ul Loptin-R (TCA GCA GCC AGG GCT GAG) 2ul Taq 酶 25ul L印tin cDNA模板 lul 双蒸水 20ul 总体积 Mul
[0100] 反应程序：预变性95°C5min，变性95°C30s，退火55°C45s，延伸72°Clmin，终延 伸 72°ClOmin，循环 30 次。
[0101] 2)将上述扩增得到的L印tin片段连接到PMD18-T载体上，得到重组质粒 pMD18-Leptin
[0102] 其反应体系为：
[0103] Leptin 基因 3iul. pMD18-T 载体 lul 双蒸水 lul Solution I 5ul 总体积 lOul
[0104] 反应时间为2h。
[0105] 3)用SalI和EcoRI双酶切pIRES2-AcGFPl载体和pMD18-L印tin载体，利用胶 回收试剂盒对所需的片段大小进行回收，将L印tin连接到pIRES2-AcGFPl载体上，得到重 组质粒pL印tin-IRES2-AcGFPl,图2为pL印tin-IRES2-AcGFPl表达载体构建流程图。
[0106] 双酶切体系：
[0107] Sal I酶 0. 5ul EcoR I酶 0. 5ul 10 XII Bbl r 2：ul 质粒DNA 5ul 双蒸水 12ul 总体积 20ui 反应时间 纽
[0108] 连接反应体系：
[0109] Leptin 4ul 载体 PIRES2-EGFP1 lul Solution I Sul.
[0110] 总体积 lOul 温度 连接时间 2h
[0111] 第二步、猪胎儿成纤维细胞转染、筛选
[0112] 1)组织消化法建立猪30日龄胎儿成纤维细胞系，冻存备用；
[0113] 2)复苏冻存备用的胎儿成纤维细胞系，进行G418毒性敏感性检测，得到10天内使 细胞全部死亡的最适浓度500ng/ul;
[0114] 3)再次复苏细胞，待细胞汇合度达到80-90 %时收集细胞并计数，将细胞用电击 缓冲液重悬，并加入30ugL印tin过表达载体，移入电击杯中，按照如下参数进行转染：方 波，电压250V，电击时间20ms，电击次数1次，电击间隔时间0s，电击杯厚度4mm;
[0115] 4)电击完成后，将细胞悬液迅速转移到100mm培养皿中进行培养，48h后收集细胞 进行初步鉴定和极度稀释培养；
[0116] 5)根据2中得到的最适浓度500ng/ul，在极度稀释培养3天后换液，开始用加有 适当浓度G418的含有10 %FBS的DMEM完全培养基进行培养，每隔3天换一次液10d后能 得到牛津杯大小的单克隆点；
[0117] 6)在显微镜下用记号笔画出单克隆点的位置，胰酶消化法抠出单克隆点放入48 孔板中进行培养，第二天换加有一半浓度G418的含有10%FBS的DMEM完全培养基进行培 养，每天观察细胞生长状况，将长满的细胞详细编号并传代至另外一个48孔板，一份用于 鉴定是否是阳性，一份用于扩大培养；
[0118] 7)待用于鉴定的细胞长满后，用胶原酶消化法收集细胞，提取基因组DNA，PCR鉴 定是否是阳性，对鉴定出来的阳性细胞系进行扩大培养和冻存备用。
[0119] 第三步、Leptin细胞的核移植
[0120] 1)卵母细胞的成熟培养
[0121] a、从屠宰场采集猪的卵巢并在4h内运回实验室。
[0122] b、挑选直径约为3_6mm的卵泡从中抽取卵丘-卵母细胞复合体，放入添加0.lmg. ml1丙酮酸、0.lmg.ml 半胱氨酸盐酸、10%猪卵泡液、10ng.mLtGF的TCM-199成熟培养 液滴中，在5%C02,38. 5°C的培养箱中培养38-42h。
[0123] 2)构建转入Letin基因的重构胚
[0124] a、取转L印tin基因的成纤维细胞，用含有0. 5%FBS的DMEM培养48h，使体细胞 处于GeSGi期。
[0125] b、卵丘-卵母细胞复合体经体外成熟培养后，用0.lmg.mL1透明质酸去除卵母细 胞外围的卵丘细胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理0. 5-lh，在操作液中 用显微注射针将极体及其周围胞质一起吸去，然后将转入L印tin基因的成纤维体细胞导 入到去核的卵母细胞的卵间隙中。
[0126] 3)电融合和电激活重构胚
[0127] 将每批约20枚重构胚胎，移入融合液中清洗三遍，在25V/mm脉冲电压，脉冲时程 为20μs，脉冲次数为1次的电融合参数下进行重构胚的电融合处理。完成后移入NCSU23 培养基中培养2小时，再把待孤雌激活的卵母细胞在激活液中清洗三遍，然后在150V/mm脉 冲电压，脉冲时程为100μs，脉冲次数为1次的电激活参数下进行电激活，重构胚移入含有 2. 2ug.mL 的培养液中后放入含有5%C02、5% 02、38. 5°C的三气培养箱中平衡2h。
[0128] 4)重构胚的体外培养
[0129] 将已平衡好的重构胚胎移入到PZM3培养液中，置于三气培养箱中培养至胚胎移 植。
[0130] 5)将重构胚移植到自然发情的代孕母猪内继续发育，代孕母猪妊娠114天后获得 转Leptin基因的克隆仔猪。
[0131] 第四步、转L印tin基因克隆仔猪的过量表达验证
[0132] 利用设计好的GFP引物和Leptin引物对转Leptin克隆仔猪的DNA和RNA进行验 证。
[0133] 本实施例在实施例1的基础上，通过SalI和EcoRI双酶切pIRES2_AcGFPl载体 和PMD18-L印tin构建出来的pL印tin-IRES2-AcGFPl载体，具有特异地、高效地增强基因表 达量的效果，实现了Leptin基因的过量表达，操作方法简单，与传统的构建方法相比，简化 了构建过程中目的基因编码蛋白系列的合成步骤；本发明还通过对现有的实验室技术进行 创造性改进，在培养过程中实现参数进行优化选择，可快速高效的使Leptin基因在大约克 猪体内实现过量表达，最终获得过量表达Leptin基因的克隆猪，成功率高，缩短培养周期， 操作简单、可控性高，实用性强。
[0134] 最终，以上实施例和附图仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述 实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细 节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种构建过量表达Lepti