水貂源性成分鉴定及动物制品中水貂、兔、狗成分的多重pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及动物分子生物学领域，具体设及水貂源性成分鉴定及动物制品中水 貂、兔、狗成分的多重PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 皮草，亦称裘皮，是指利用动物的皮毛所制成的服装，它可能是人类最早的衣料之 一。随着时代的发展，皮草已逐渐成为奢侈和财富的象征。常用来制作皮草的动物包括貂、 狐，兔、骆、海狸等，价格昂贵，是冬季女±高档服饰之一。人们常说的裘皮，一般指的是貂 皮。
[0003] 水貂在动物分类学上属于哺乳纲、食肉目、關科、關属，是小型珍贵毛皮动物之一。 貂皮是东北=宝之一，素有"裘中之王"之称，在国外被称为"软黄金"。貂皮属于细皮毛裘 皮，皮板优良，轻柔结实，毛绒丰厚，色泽光润。用它制成的皮草服装雍容华贵，是理想的裘 皮制品，因此它又成为了富贵的象征。貂皮分紫貂皮、白貂皮、黑貂皮、水貂皮等，W紫貂皮 更为名贵。其针毛粗、长、亮，毛被绵软，绒毛铜密，质软坚初，为高级毛皮，多用于服装的外 套、长袍、披肩等。貂皮具有"风吹皮毛毛更暖，雪落皮毛雪自消，雨落皮毛毛不湿"的特点。
[0004] 近些年，随着生活水平的提高，名贵的貂皮服装受到越来越多消费者的青睐。由 于貂皮价格昂贵，一些不法经营者为牟取暴利，买由黄鼠狼、狐狸或懒兔皮甚至狗皮制成的 服装，然后染色翻新成貂皮制品。市场上买到的貂皮的衣领也许就是普通的兔毛或者狗皮 经过深加工制成的，普通消费者根本无法分辨。此外，也有许多不法商贩将水貂禍体肉、内 脏或骨等经过加工制作或渗入到食用肉制品和饲料中，欺诈消费者，破坏市场秩序。采用传 统的形态学方法鉴别毛皮、肉类或饲料成分来源，人为误差较大，容易误判，准确率较低。目 前，我国已发表的专利中有可W鉴别紫貂皮和松貂皮（李波，徐艳春.扩增貂属物种细胞色 素b基因的引物及鉴别紫貂、松貂的方法[P]，中国专利：CN101792816A，2010-8-4.)，也 有检测貂源性成分的方法，但设及到的动物物种较少（李明成，张丽华，王冰梅，孙红霞.貂 屯、DNA检测试剂盒及鉴定方法[P]，中国专利：CN101434990A，2009-5-20.)或方法繁杂、 用时较长（李光玉，孙伟丽，赵家平等.一组检测水貂源性成分的扩增引物[P]，中国专利： CN102643912B，2014-1-8)，不能简便快捷地鉴定貂皮与其他动物毛皮。水貂肉制品和饲 料中水貂源性成分的鉴别研究也鲜有报道。因此，如何有效、准确地判别出动物性制品是否 属于水貂制品，并建立一种简单易行的检测方法具有紧迫性。
【发明内容】
[00化]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可用于水貂源性成分特异性检 测的引物；
[0006] 本发明的第二个目的在于提供用于水貂源性成分检测的检测试剂盒；
[0007] 本发明的目的还在于提供水貂源性成分鉴定及动物性制品中兔源、狗源成分的鉴 定方法。
[0008] 为实现上述目的，本发明从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面进行 水貂基因组特异序列基因的筛选，通过对非水貂物种及不同的水貂品种中的检测筛选，选 取水貂中特异性的基因片段作为检测分子并设计特异性引物，利用PCR电泳技术对其种间 特异性、种内保守性和灵敏度等结果进行检测。经过大量分析和实验工作，最终获得可供检 测使用的特异DNA分子，其核巧酸序列如序列表SEQIDNo. 1所示。
[0009] 基于此，本发明首先提供一种水貂特异性引物，其特异性扩增SEQIDNo. 1所示的 核巧酸序列或该序列的特异性片段。
[0010] 优选地，引物长度为18~27bp。引物的设计需要考虑是否容易发生错配、扩增片 段长度、反应溫度等多方面。 1 ] 优选地，该引物序列如下：
[0012] MUSTLA-F: 5' -TTCGGCGCTGCCTTMTTGTC-3f
[0013]MUSTLA-R:5' -AAGACCTGGGACCCGAGAGTT-3';
[0014] 或该引物向5'、3'端延伸或修饰得到的仍能特异性扩增SEQIDNo. 1所示序列 (长度22化P)的引物。
[0015] 进一步本发明提供含有上述特异性引物的检测试剂盒。
[0016] 优选地，所述试剂盒还包括下述兔和/或狗特异性引物：
[0017] (1)对狗基因组DNA进行扩增生成狗特异性扩增片段（长度3Ubp)的引物对I: 阳0化]CANIS-F: 5，-GCGGCAAAGTTMCGGCAGT-3，
[0019]CANIS-R:5'-GGATGGGAAGCAAACTCCGA-3' ；
[0020] (2)对兔基因组DNA进行扩增生成兔特异性扩增片段（长度209bp)的引物对II :
[0021] OCU-F:5' -TAGCAGTAGGGATGACAGGGTTT-3，
[0022] OCU-R: 5' -GCCTTAGAGTAGGGTCTTTTTGG-3 >。 阳02引优选地，所述试剂盒还包括下述试剂中的一种或多种：Taq酶、dNTPs、MgClz、PCR缓冲液、阳性对照DNA模板、双蒸水；或者还包括下述试剂中的一种或多种：TaqDNA MasterMix、阳性对照DNA模板、双蒸水。
[0024] 所述阳性对照DNA模板为水貂DNA模板。 阳0巧]优选地，所述阳性对照DNA模板还包括兔、狗DNA模板中的一种或多种。
[00%] 进一步，本发明提供上述的水貂特异性引物或检测试剂盒在水貂源性成分鉴定或 在肉类、饲料或皮毛制品分子鉴定中的应用。可对动物制品中水貂、兔、狗成分多重PCR检 测。
[0027] 本发明还提供水貂源性成分鉴定及其制品中渗入兔、狗成分的检测方法，其步骤 如下所述： 阳02引 1)提取样品基因组DNA;
[0029] 2)PCR扩增：
[0030] A)用所述的水貂特异性引物进行PCR扩增，并W水貂DNA模板为阳性对照，W双蒸 水为空白对照；
[0031] B)用所述的试剂盒，用所述的水貂特异性引物、兔和/或狗特异性引物分别进行 PCR扩增，W水貂DNA模板为阳性对照，同时兔、狗DNA模板中的一种或多种为阳性对照，W 双蒸水为空白对照；
[0032] C)用所述的试剂盒，进行多重PCR扩增，W水貂、兔、狗等比例混合的DNA模板为阳 性对照，W双蒸水为空白对照；
[0033] 3)对PCR扩增产物进行检测和结果判定。
[0034] 具体地，一种水貂源性成分及动物制品中水貂、兔、狗成分的普通PCR检测方法， 其步骤如下所述： 阳03引 1)提取样品基因组DNA ;
[0036] 2)用上述的水貂特异性引物SEQ ID No. 2&3进行PCR扩增，并W水貂DNA模板为 阳性对照，W双蒸水为空白对照；
[0037] 3)对PCR扩增产物进行电泳检测和结果判定。
[00測优选地，其中步骤^PCR扩增的反应试剂如如表1 :
[0039]表1本发明普通PCR扩增的反应体系
[0041] 步骤2)所述的PCR反应程序如下：
[0042] 95°(：预变性5111111;95°(：变性3〇3,62°(：退火3〇3,72°(：延伸153,30次
[0043]循环；4°C降溫2min ;
[0044] 结果判定方法是：当PCR反应产物与阳性对照扩增产物相符，且空白样品无扩增 产物时，判定样品中检测出水貂源性成分；当PCR反应无扩增产物或产物与阳性对照扩增 产物不符，且空白对照无扩增产物时，判定样品中未检测出水貂源性成分；如果阳性样品未 检测预期片段，说明试剂失效或操作失误；若空白对照与阳性样品均检出，说明试剂污染或 操作失误。
[0045] 此外，W兔、狗基因组DNA为阳性对照，利用上述引物或试剂盒还可W进一步判断 其是否含有兔或狗源性成分。
[0046] 此外，本发明还提供动物制品中水貂、狗、兔成分的多重PCR检测方法，将上述的 引物SEQ ID No. 2&3和I~II按6:5:2的比例混合，可进行多重PCR扩增，W水貂、狗、兔等 比例混合DNA模板为阳性对照，W双蒸水为空白对照；利用上述引物或试剂盒还可W进一 步进行水貂、狗、兔的快速检测，方便混合样品的检测。
[0047] 优选地，其中多重PCR扩增的反应试剂如表2: W48] 表2本发明多重PCR扩增的反应体系
[0050] 本发明中检测结果可用琼脂糖凝胶电泳呈现，也可用测序或其他有效方法检测； 提取样品DNA的方法可用苯酪-氯仿提取法，也可使用公认的、具有相同效力的其他提取方 法。
[0051] 本发明提供了有效的、精准的、可靠的水貂源性成分分子鉴定方法，所组装的试剂