L的模板浓度即有 扩增，表明特异性引物所扩增片段具有较好的灵敏性。
[0092] 实施例3检测水貂源性产品中渗入非水貂源性源性产品的引物组
[0093] 本发明是对于动物制品来源的检测，通过各物种相应引物PCR扩增的情况，判断 是否为或含有某物种的DNA，进而判定是否有某物种的动物源性成分渗假。
[0094] 1样品中DNA的提取
[0095] 各物种DNA的提取及保存方法同前实施例1中所述。
[0096] 2引物的设计和筛选
[0097] 为了寻找各物种特异的检测序列，我们从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝 数等方面进行特异序列的筛选，通过与非本物种及本物种不同品种的核酸序列比对，筛选 种内较保守、物种间特异的核巧酸序列作为检测分子。选取其中结果较好的序列设计各自 物种引物序列，并通过实验进一步筛选特异性较好的引物用于后续试验。
[009引一组水貂、兔、狗的PCR鉴定用引物体系，由下列引物对组成：
[0099] (1)对水貂基因组DNA序列进行扩增生成水貂特异性扩增片段（220bp)的引物 对：
[0100] MUSTLA-F : 5' -TTCGGCGCTGCCTTMTTGTC-3 f
[0101]MUSTLA-R:5'-AAGACCTGGGACCCGAGAGTT-3'; 阳102] (2)对狗基因组DNA进行扩增生成狗特异性扩增片段（317bp)的引物对：
[0103]CANIS-F :5 >-GCGGCAAAGTTMCGGCAGT-3>
[0104]CANIS-R:5'-GGATGGGAAGCAAACTCCGA-3'；
[0105] (3)对兔基因组DNA进行扩增生成兔特异性扩增片段（209bp)的引物对：
[0106] OCU-F :5' -TAGCAGTAGGGATGACAGGGTTT-3>
[0107] OCU-R:5'-GCCTTAGAGTAGGGTCTTTTTGG-3> ; 阳10引3PCR检测
[0109] 3. 1为了确保所选用引物可准确、有效地鉴定出水貂属样品及其中是否渗入狗或 兔的样品成分，我们对各引物进行了特异性检测，反应体系如上述表1。
[0110] 3. 2进行PCR反应的程序为： 阳111] 95°C预变性5min;95°C变性30s，62°C退火30s，72°C延伸153,30次循环；4°(：降溫 2min； 阳11引3. 3在试样PCR反应的同时，设置空白对照、阴性对照、阳性对照。
[0113] 3. 4反应结束后取出PCR管，对PCR反应产物进行电泳检测：该电泳过程及条件同 实施例1中的电泳。
[0114] 所得凝胶成像结果如图4所示。分别用水貂、兔、狗特异性引物W该3个物种的基 因组DNA为模板进行PCR扩增反应，很好的验证了各物种特异性引物的有效性和特异性。由 图4可W看出，兔、狗特异性引物均能很好的扩增出各自对应物种的特异性大小的条带，而 在水貂中均未扩增出目的条带。 阳11引实施例4多重PCR
[0116] 为了方便快速地检测，我们在保证各引物有效扩增且特异性良好的情况下，同时 考虑各引物的扩增效率，将水貂、狗、兔的引物量按照6:5:2的比例混合后备用： 阳117] 4.1反应总体积同表2.
[0118] 4. 2 DNA样品：取浓度为25ng/ y L的水貂、兔、狗基因组DNA等比例混合作为反应 所需模板。
[0119] 4. 3反应程序同实施例1。
[0120] 4. 4电泳检测选用电泳缓冲液为IX TBE，其他同实施例1。 阳121] 所得凝胶成像结果如图5所示。实验结果表明上述各引物特异性良好，可方便、有 效地将水貂与兔、狗区分开。
[0122] 实施例5试剂盒的组装
[0123] 该试剂盒的组成包括： 阳124] 引物（各物种引物对沈Q ID No. 2&3和I~II各一份）； 阳125] 2 Xhq DNA MasterMix ;
[0126] 阳性对照DNA模板（水貂、兔、狗DNA模板各一份）； 阳127] 双蒸水。
[0128] 本试剂盒-20°C储存12个月不影响使用效果。
[0129] 试剂盒的应用方法：
[0130] 1.依据需要，按照上述各实施例1或实施例3或实施例4的PCR反应体系加样。 阳13U 其中，2X化q DNA MasterMix(购自北京艾德莱生物科技有限公司）是将PCR反应 所需的Taq酶、dNTP混合物、MgClzW及反应缓冲液预先配置成2倍浓度的混合物。
[0132] 2.依据实施例1或实施例3或实施例4的PCR扩增条件上样 阳13引 3.反应结束后取5化PCR扩增产物，3.0%的琼脂糖凝胶电泳（技术参数：2V/ cm~5V/cm，电泳15min~30min)，用漠化乙锭染色，凝胶成像系统检测结果。
[0134] 每个反应需设置空白对照和阳性对照，反应体系及扩增条件同受测样品。
【主权项】
1. 水貂特异性引物，其特异性扩增SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列。2. 根据权利要求1所述的特异性引物，其特征在于，该引物序列如下： MUSTLA-F:5'-TTCGGCGCTGCCTTAATTGTC-3' MUSTLA-R:5,-AAGACCTGGGACCCGAGAGTT-3，； 或该引物向5'、3'端延伸或修饰得到的仍能特异性扩增SEQIDNo. 1所示序列的引物。3. 含有权利要求1或2所述特异性引物的检测试剂盒。4. 根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括下述引物中的 一种或多种特异性引物： (1) 对兔基因组DNA进行扩增生成兔特异性扩增片段的引物对： 0CU-F:5'-TAGCAGTAGGGATGACAGGGTTT-3' 0CU-R:5'-GCCTTAGAGTAGGGTCTTTTTGG-3' ； (2) 对狗基因组DNA进行扩增生成狗特异性扩增片段的引物对： CANIS-F: 5 ' -GCGGCAAAGTTAACGGCAGT-3 ' CANIS-R:5' -GGATGGGAAGCAAACTCCGA-3'。5. 根据权利要求3或4所述的检测试剂盒，其特征在于，其还包括下述试剂中的一种或 多种：Taq酶、dNTPs、MgCl2、PCR缓冲液、阳性对照DNA模板、双蒸水；或者还包括下述试剂 中的一种或多种：TaqDNAMasterMix、阳性对照DNA模板、双蒸水。6. 根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照DNA模板为鼬科中的 水貂基因组DNA模板，所述空白对照为双蒸水。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照DNA模板还包括兔、狗 DNA模板中的一种或多种。8. 权利要求1或2所述的水貂特异性引物或权利要求3~7任一项所述的检测试剂盒 在水貂源性成分或在肉类、饲料或皮毛制品分子鉴定中的应用。9. 水貂源性成分鉴定及其制品中掺入兔、狗成分的检测方法，其步骤如下所述： 1) 提取样品基因组DNA; 2. PCR扩增： A) 用权利要求1或2所述的引物进行PCR扩增，并以水貂DNA模板为阳性对照，以双蒸 水为空白对照； B) 用权利要求4-7任一项所述的试剂盒，用所述的水貂特异性引物、兔和/或狗特异性 引物分别进行PCR扩增，以水貂DNA模板为阳性对照，同时兔、狗DNA模板中的一种或多种 为阳性对照，以双蒸水为空白对照； C) 用权利要求4-7任一项所述的试剂盒，进行多重PCR扩增，以水貂、兔、狗等比例混合 的DNA模板为阳性对照，以双蒸水为空白对照； 3) 对PCR扩增产物进行检测和结果判定。
【专利摘要】本发明提供了一种水貂源性成分鉴定及动物制品中水貂、兔、狗成分的多重PCR检测试剂盒，属于动物源性成分分子检测技术领域。本发明试剂盒包括水貂、兔、狗各物种特异性引物、反应试剂以及阳性和空白对照。水貂特异性引物是能特异性扩增SEQ？ID？No.1所示的核苷酸序列的引物对。采用本发明的引物扩增样品DNA，对PCR扩增产物进行分析，可判定样品是否含有水貂种源性成分；同时，能鉴别是否掺有兔源或狗源成分，为毛皮制品的分子鉴定提供手段；另外，通过多重PCR检测，可一次性鉴别水貂源、兔源和狗源成分，建立肉类、毛皮掺假和饲料成分鉴别的有效方法。该方法和试剂盒具有简便、快速、全面、特异性强的特点，且成本较低，适用性广。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105296477
【申请号】CN201510815144
【发明人】刘榜, 王文君, 吴清清, 夏瑾华, 张庆德
【申请人】华中农业大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月20日