机模拟，对磷酸位置芘修饰核酸探针在和完全互补DNA配对前后 巨大的荧光差别进行了分析。当磷酸位置芘修饰的核酸探针以单链形式存在时，由于柔性 连接臂的存在，芘可以与邻近的碱基充分发生的相互堆积作用，使得芘自身的荧光 被邻近碱基通过光致荧光转移（PET)效应淬灭掉；当与完全互补的DNA序列配对后，芘被挤 出碱基堆积区域，完全暴露在水相的极性环境中，荧光不能被有效淬灭。
[0040] 本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0041] 本发明将芘等荧光基团通过烷基链柔性连接在5' -DMT保护的脱氧核苷上，制得 磷酸位置发色图案定点修饰的亚磷酰胺单体化合物，之后将该单体使用固相合成法修饰到 寡聚核苷酸序列上得到相应的寡聚核苷酸荧光探针。本发明提出的在寡聚核苷酸的磷酸位 置进行芘等发色团修饰的新策略，不会对核酸的双链稳定性和二级结构产生不利影响。据 此得到的磷酸位置发色团修饰寡聚核苷酸探针本身没有荧光发射，和完全配对的靶链结合 后，荧光增强显著，最高可达23. 5倍，响应速度快，不超过20秒；同时该探针对于错配碱基 识别明显，几乎没有荧光发射；此外，磷酸位置发色团修饰的核酸探针对于RNA有着比DNA 更强的识别能力。
[0042]本发明磷酸位置发色团修饰的寡聚核苷酸探针各项性质优异，可以应用于基因单 碱基突变分析和PCR反应过程检测，有望在单碱基多态性检测和生化样品中核酸检测方面 获得更广泛的应用。
【附图说明】
[0043] 图1为磷酸位置芘修饰脱氧胸苷亚磷酰胺单体的合成；a)磷酸位置柔性丁基链连 接芘的胸苷亚磷酰胺单体合成；b)磷酸位置刚性亚甲基连接芘的胸苷亚磷酰胺单体合成。
[0044] 图2a)磷酸位置芘修饰脱氧胸苷亚磷酰胺单体；b)磷酸位置芘修饰的寡聚核苷 酸。
[0045] 图3芘修饰核酸探针S0和完全配对序列S2形成双链以及天然双链的圆二色谱。
[0046] 图4a)单链探针S0和对应完全配对链及单碱基错配链的荧光谱图；b)单链探针 S0和完全配对链S2形成双链的动力学过程。
[0047] 图5为单链探针S0和完全互补链及含错配碱基链结合后在波长378nm下的相对 荧光强度。
[0048] 图6为单链探针S0和对应完全配对RNA形成双链的荧光谱图。
[0049] 图7为磷酸位置芘修饰探针S0对完全配对底物的浓度效应：a)不同浓度底物的 荧光图谱；b)378nm下荧光发射强度与底物浓度的线性关系。
[0050] 图8为PCR过程中的荧光谱图：a)以模板1进行PCR反应在不同循环数下的荧光 谱图；内插图为分别使用模板1和模板2在378nm下的荧光强度与循环次数的关系图；b) 以模板2进行PCR反应在不同循环次数下的荧光光谱图。
[0051] 图9人类黑色素瘤braf基因突变检测的荧光谱图。
[0052] 图10为磷酸位置芘修饰的寡聚核苷酸探针通过不对称PCR反应检测Braf基因 V600的单碱基突变。
[0053] 图11茈修饰的i-motif核酸序列在不同pH值下的荧光光谱图。
[0054] 图12茈修饰的i-motif核酸序列的荧光强度与pH值的线性对应关系。
【具体实施方式】
[0055] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0056] 实施例1磷酸位置芘丁醇修饰亚磷酰胺单体的合成
[0057] 1、化合物ΡΒ-0的制备
[0058] 2M浓度的硼烷二甲硫醚的四氢呋喃溶液3mL，冰浴冷却至零度；芘丁酸（560mg， 1.94mm〇L，购买于百灵威公司）溶解于新蒸的无水四氢呋喃溶液5mL。冰浴搅拌下，将芘丁 酸的四氢呋喃溶液逐滴加入到硼烷溶液中，室温搅拌过夜。将反应混合物至于冰浴搅拌下 ，逐滴加入甲醇淬灭反应至无气泡产生，继续搅拌2小时。对反应体系减压浓缩至少量，加 入乙酸乙酯30mL;混合溶液用饱和碳酸钠溶液洗涤（30mLX3)。收集有机相，无水硫酸钠干 燥，减压旋去乙酸乙酯。残余物使用柱层析法快速分离，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯1: 1，最 终得到浅黄色固体 480mg(l. 74mmoL，产率 90. 2% )。iH-NMRGOOMHz,CDC13)δ= 8. 27(d,J =9. 2Hz, 1H), 8. 15-8. 17 (dd,J= 2. 2Hz, 7. 8Hz, 2H), 8. 11 (d,J= 1. 8Hz, 1H), 8. 09 (d,J= 3. 4Hz, 1H), 7. 97-8. 02 (m, 3H), 7. 86 (d,J= 7. 8Hz, 1H), 3. 71 (t,J= 6. 5Hz, 2H), 3. 38 (t,J =7. 6Hz, 2H), 1. 90-1. 98(m, 2H), 1. 71-1. 78(m, 2H). 13C-NMR(100MHz,CDC13)δ= 136. 7, 1 31. 5, 130. 9, 129. 8, 128. 6, 127. 5, 127. 2, 126. 6, 125. 8, 125. 1, 124. 9, 124. 8, 124. 7, 123. 4, 62. 9, 33. 3, 32. 8, 28. 0·MS(ESI-TOF+)测量值Μ+274· 33,C2(]H1S0,理论值Μ+274· 36.
[0059] 2、化合物ΡΒ-1的制备
[0060] 在氮气保护下，双二异丙基氨基氯化磷（293mg，1.ImmoL)溶解于5mL无水四氢咲 喃中，并加入lmL三乙胺，冰浴冷却至0°C。化合物PB-0(275mg，1.ImmoL)溶解于lmL无水四 氢呋喃，并逐滴加入到前者溶液中，室温搅拌过夜。反应完毕后，快速过滤掉不溶物；滤液快 速旋干得到浅黄色固体PM-1。不做进一步纯化，直接用于下步反应。31PNMR(162MHz，⑶Cl3) δ= 121. 8.
[0061]3、化合物PB-2的制备
[0062] 在氮气保护下，DMT保护的脱氧胸苷（350mg，0. 64mmoL)和四氮唑（70mg，1.OmmoL) 溶于1. 5mL无水二氯甲烷中。上步反应得到的PB-1在氮气保护下全部溶解于1. 5mL无水 二氯甲烷中，加入到前者溶液中。混合物氮气保护下室温反应2小时，直接上柱，快速分离。 洗脱剂石油醚/乙酸乙酯/三乙胺1:1: 〇. 03,得到浅黄色泡沫状固体330mg(0. 36mm〇L，两 步产率 36. 4)。iH-NMRGOOMHz，CDC13)δ= 8. 13-8. 26 (m，9H)，7. 49 (s，1H)，7. 30-7. 35 (m，2 H)，7. 13-7. 25 (m，7H)，6. 73-6. 82 (m，4H)，6. 20-6. 25 (m，J= 6. 8, 7. 3Hz，1H)，4. 58-4. 68 (m, 1H), 4. 12-4. 17 (dd,J= 20. 4Hz, 1H), 3. 71-3. 75 (dd,J= 18. 6Hz, 8. 0Hz, 6H), 3. 47-3. 65 (m, 4H), 3. 41-3. 46 (m,J= 8. 2Hz, 1H), 3. 35-3. 39 (t,J= 8. 4Hz, 1H), 3. 17-3. 21 (t,J= 8. 2Hz ,2H), 2. 42-2. 53 (m, 1H), 2. 21-2. 31 (m, 1H), 1. 76-1. 96 (m, 3H), 1. 63-1. 70 (m, 1H), 1. 38 (s, 3 H), 1. 10-1. 14(q,J= 8. 0Hz, 6. 6Hz, 9H), 1. 00-1. 02(d,J= 8. 0Hz, 3H). 31P-NMR(162MHz，CD Cl3)δ= 146. 7, 147. 4.MS(ESI-T0F+)，理论值 948. 43,C57H62N30sP;测量值[M+H]+949. 21，[M +Na]+971. 13.
[0063] 磷酸位置柔性丁基链链接芘的胸苷亚磷酰胺单体合成见图1 (a)。对于芘修饰的其 他A，G和C亚磷酰胺单体，通过该方法也能快速合成。
[0064] 实施例2磷酸位置芘甲醇修饰亚磷酰胺单体的合成
[0065]1、化合物PM-1的制备
[0066] 在氮气保护下，双二异丙基氨基氯化磷（293mg，1.ImmoL)溶解于5mL无水四氢咲 喃中，并加入lmL三乙胺，冰浴冷却至0°C。花甲醇（230mg，1.OmmoL)氮气保护下溶解于lmL 无水四氢呋喃，逐滴加入前者溶液中，室温搅拌过夜。反应完毕后，快速过滤掉不溶物，滤液 迅速旋干得到浅黄色固体。不做进一步处理，直接用于下步反应。31PNMR(162MHz，⑶Cl3) δ= 121. 8.
[0067]2、化合物PM-2的制备
[0068] 在氮气保护下，DMT保护的脱氧胸苷（350mg，0. 64mmoL)和四氮唑（80mg，1.ImmoL) 溶解于1. 5mL无水二氯甲烷中。上部反应得到的PM-1全部在氮气保护下溶解于1. 5mL无水 二氯甲烷，加入到前者溶液中。室温反应2小时，混合溶液直接上柱分离，洗脱剂为石油醚/ 乙酸乙酯/三乙胺1:1:0. 03,得到浅黄色泡沫状固体300mg(0. 33mmoL，两步产率33. 3% )。 i-NMRGOOMHz，CDC13)δ= 7. 82-8. 22 (m，9H)，7. 59 (dd，J= 24Hz，1H)，7. 36-7. 38 (dd，J =8Hz，2H)，7. 20-7. 30 (m，7H)，6. 75-6. 80 (m，4H)，5. 30-5. 40 (m，2H)，4. 56-4. 63 (m，1 H), 4. 01-4. 06 (dd,J= 3. 2, 12. 6Hz, 2H), 3. 69 (s, 6H), 3. 6