杂交瘤或mAbs，以鉴定出具有特定性质(例如阻碍肌肉生长抑制素诱导的活性） 的mAbs。此类筛选的例子提供于下文实施例中。
[0099]还可使用被称为遗传免疫的工艺来生产单克隆抗体。例如，编码感兴趣的抗原的 核酸可被掺入病毒载体(例如腺病毒载体）。然后使用得到的载体在合适的宿主动物(例如 非肥胖性糖尿病，或N0D，小鼠）中发展出针对感兴趣的抗原的免疫应答。该技术被Ritter 等，，Biodrugsl6(l) :3-10(2002)详细描述，其公开内容通过引用并入本文。
[0100]抗体结合位点中央的互补性决定区（CDRs)的分子进化也已被用于分离具有增加 的亲和性的抗体，例如，具有增加的针对c-erbB-2的亲和性的抗体，如Schier等，，1996， J. Mol.Biol.263:551所述。因此，此类技术可用于制备针对肌肉生长抑制素的抗体。
[0101] 针对肌肉生长抑制素的抗原结合蛋白质可用于例如检验中以体外或体内检测肌 肉生长抑制素多肽或表达肌肉生长抑制素的细胞的存在。抗原结合蛋白质还可用于通过免 疫亲和色谱来纯化肌肉生长抑制素蛋白质。另外还能阻碍肌肉生长抑制素和肌肉生长抑制 素受体(或其亚单位）的相互作用的抗原结合蛋白质可用于抑制此类相互作用导致的生物 活性。阻碍抗原结合蛋白质可用于本发明的方法。作为肌肉生长抑制素拮抗剂发挥功能的 此类抗原结合蛋白质可用于治疗任何肌肉生长抑制素诱导的病况，包括但不限于肌肉减少 症、恶病质和肌肉消耗的病况。在一种实施方式中，通过涉及对转基因小鼠进行免疫的流程 产生的人抗肌肉生长抑制素单克隆抗体被用于治疗此类病况。在另一实施方式中，人化的 抗肌肉生长抑制素单克隆抗体被用于治疗此类病况。
[0102] 抗原结合蛋白质可用于体外流程，或体内施用，以抑制肌肉生长抑制素诱导的生 物活性。肌肉生长抑制素导致或恶化(直接或间接)的病症(其例子提供于本文中）由此可被 治疗。在一种实施方式中，本发明提供了一种治疗性方法，所述方法包括以有效降低肌肉生 长抑制素诱导的生物活性的量向需要其的哺乳动物体内施用阻碍肌肉生长抑制素的抗原 结合蛋白质。
[0103] 本发明的抗原结合蛋白质包括抑制肌肉生长抑制素的生物活性的部分人单克隆 抗体或完全人单克隆抗体。一种实施方式涉及至少部分阻碍人肌肉生长抑制素与肌肉生长 抑制素受体(或其亚单位）的相互作用的单克隆抗体。在一种实施方式中，通过用肌肉生长 抑制素免疫原免疫转基因小鼠来产生抗体。在又一实施方式中，免疫原是人肌肉生长抑制 素多肽(例如经转化或转染以表达肌肉生长抑制素的细胞，或天然表达肌肉生长抑制素的 细胞）。源于此类经免疫的小鼠的杂交瘤细胞系(其中所述杂交瘤分泌结合肌肉生长抑制素 的单克隆抗体)也是本文提供的。
[0104] 虽然人抗体、部分人抗体或人化抗体对于很多应用（特别是对涉及将抗体施用给 人受试者的那些应用）来说是合适的，但其他类型的抗原结合蛋白质将适合于某些应用。本 发明的非人抗体可以例如源于任何产生抗体的动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、驴或非人灵 长类(例如猴(例如猕猴或恒河猴)或猿(例如黑猩猩））。本发明的非人抗体可用于，例如，体 外应用或基于细胞培养的应用，或者其中对本发明的抗体的免疫应答将不发生、不显著、可 被预防、不成为问题或者是需要的任何其他应用。在一种实施方式中，本发明的非人抗体施 用给非人受试者。在又一实施方式中，非人抗体在非人受试者中不引发免疫应答。在又一实 施方式中，非人抗体来自与非人受试者相同的物种，例如，本发明的小鼠抗体施用给小鼠。 可例如通过用想要的免疫原（例如表达肌肉生长抑制素的细胞或可溶肌肉生长抑制素多 肽)免疫该物种的动物、或者使用产生该物种的抗体的人工系统(例如用于产生特定物种的 抗体的基于细菌或噬菌体的系统）、或者通过将来一种物种的抗体转化为来自另一物种的 抗体(通过例如用来自其他物种的恒定区替换抗体的恒定区）、或通过替换抗体的一个或多 个氨基酸残基以使得其更接近来自其他物种的抗体的序列，来制造来自特定物种的抗体。 在一种实施方式中，抗体是包含源于两种或多种不同物种的抗体的氨基酸序列的嵌合抗 体。
[0105] 可通过大量传统技术中的任何来制备抗原结合蛋白质。例如，可适用本领域已知 的任何技术，从天然表达它们的细胞中纯化它们(例如，可从产生其的杂交瘤纯化抗体），或 在重组表达系统中生产抗体。见例如，Monoclonal Antibodies，Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses，Kennet等，（eds·)，Plenum Press，New York(1980) 和Antibodies : A Laboratory Manual,Harlow and Land(eds.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,(1988)〇
[0106] 本领域已知的任何表达系统可用于制造本发明的重组多肽。通常，用包含编码想 要的多肽的DNA的重组表达载体来转化细胞。可利用的宿主细胞包括原核生物、酵母或高级 真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如大肠杆菌或杆菌(bacilli)。 高级真核生物细胞包括昆虫细胞和建立的哺乳动物来源的细胞系。合适的哺乳动物细胞系 的例子包括猴肾细胞的⑶S-7系（ATCC CRL 1651)(Gluzman等，，1981，Cell 23:175)、L细 胞、293细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL 163)、中华仓鼠卵巢(CH0)细胞、HeLa细胞、BHK (ATCC CRL 10)细胞系和源于非洲绿猴肾细胞系CVI(ATCC CCL 70)的CVI/EBNA细胞系，如 McMahan et al.，1991，EMB0 J. 10:2821所述。关于使用细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿 主的合适克隆和表达载体由Pouwels等，（Cloning Vectors:A Laboratory Manual, Elsevier,New York, 1985)所述。
[0107] 可在促进多肽表达的条件下培养转化的细胞，并通过传统的蛋白质纯化流程来回 收多肽。一种此类纯化流程包括使用亲和色谱，例如在具有结合至其的肌肉生长抑制素的 全部或一部分的基质上。被考虑用于本文的多肽包括基本上不含污染的内源材料的基本上 均质的重组哺乳动物抗肌肉生长抑制素抗体多肽。
[0108] 可通过大量已知技术中的任何来制备抗原结合蛋白质，并且针对想要的性质加以 筛选。某些技术涉及分离编码感兴趣的抗原结合蛋白质(例如抗肌肉生长抑制素抗体)的多 肽链(或其部分）的核酸以及通过重组DNA技术操作核酸。可将核酸融合至另外的感兴趣的 核酸，或对其进行改造(例如通过诱变或其它传统技术）以例如添加、缺失或取代一个或多 个氨基酸残基。
[0109] 在一个方面，本发明提供了本发明的抗肌肉生长抑制素抗体的抗原结合片段。此 类片段可完全由源于抗体的序列构成或者可包含额外的序列。抗原结合片段的例子包括 Fab、F (ab '）2、单链抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体和结构域抗体。其它例子被提供于 Lunde等，，2002，Biochem.Soc·Trans·30:500-06中。
[0110] 单链抗体可通过下述方式形成:将重链和轻链可变结构域(Fv区）片段经由氨基酸 桥联(短肽接头)连接起来，产生单多肽链。
[0111]已通过融合编码下述肽接头的DNA制备了此类单链Fvs(scFvs)，所述肽接头是编 码两个可变结构域多肽(VL和VH)的DNA之间的。得到的多肽可折叠回到它们自身上，以形成 抗原结合单体，或者它们可形成多聚体(例如二聚体、三聚体或四聚体），这取决于两个可变 结构域之间的柔性接头的长度（Kortt等，，1997，Prot · Eng .10:423; Kortt等，，2001， Biomol .Eng. 18:95-108)。通过组合不同的包含Vl和Vh的多肽，可形成与不同表位结合的多 聚scFvs(Kriangkum等，，2001，Biomol .Eng. 18:31-40)。开发来用于产生单链抗体的技术包 括美国专利No .4,946,778、Bird, 1988, Science 242:423、Hus ton等，，1988， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879、Ward等，，1989，Nature 334:544、de Graaf等，，2002， Methods Mol Biol .178:379-87中描述的那些。
[0112]本发明的抗原结合蛋白质(例如抗体、抗体片段和抗体衍生物)可包含本领域已知 的任何恒定区。轻链恒定区可以是例如κ或λ型轻链可变区，例如人κ或λ型轻链可变区。重链 恒定区可以是例如α、δ、ε、γ或μ型重链可变区，例如人α、δ、ε、γ或μ型重链可变区。在一种 实施方式中，轻链或重链恒定区是天然存在的恒定区的片段、衍生物、变体或突变蛋白质。 [0113]已知有用于从感兴趣的抗体获得不同的亚类或不同的同种型的抗体的方法，即， 亚类迀移(subclass switching)。由此，例如，IgG抗体可源于IgM抗体，并且反之亦然。此类 技术允许制备具有给定抗体(亲本抗体）的抗原结合性质但也显示出与不同于亲本抗体的 抗体同种型或亚类相关的生物学性质的新抗体。可利用重组DNA技术。编码特定抗体多肽的 克隆的DNA可用于此类流程，例如，编码想要的同种型的抗体的恒定区的DNA。还见Lantto 等，，2002，Methods Mol. Biol. 178:303-16。此外，如果想要IgG4的话，还可能希望在铰链区 引入点突变(CPSCP->CPPCP)，如Bloom等，，1997，Protein Science 6:407所述(其通过引用 并入本文），以减轻形成Η链内二硫键(可导致IgG4抗体中的异质性)的趋势。
[0114] 此外，还已知用于获得具有不同性质（即，针对其结合的抗原的变化的亲和性）的 抗原结合蛋白质的技术。一种此类技术被称为链重排，其涉及在丝状细菌噬菌体表面上展 示免疫球蛋白可变结构域基因库，其也被称为噬菌体展示。链重排已被用于制备针对半抗 原2-苯基恶唑-5-酮的高亲和性抗体，如Marks等，，1992，BioTechnology，10:779所述。
[0115] 在又一实施方式中，本发明提供了具有从肌肉生长抑制素解离的低解离常数的抗 原结合蛋白质。在一种实施方式中，抗原结合蛋白质具有200pM的Kd，或100pM或更低的Kd。在 又一实施方式中，Kd为10pM或更低;在又一实施方式中，其为5pM或更低，或者其为4pM、3pM 或2pM或更低。在又一实施方式中，Kd与本文在实施例中描述的抗体基本上相同。在又一实 施方式中，抗原结合蛋白质以与本文在实施例中描述的抗体基本上相同的Kd结合肌肉生长 抑制素。
[0116] 在又一实施方式中，本发明提供了具有比其针对GDF-11的解离常数实质上更低的 针对肌肉生长抑制素的解离常数(Kd)的抗原结合蛋白质。在又一实施方式中，针对肌肉生 长抑制素的解离常数比针对GDF-11的低1000倍，或者其针对肌肉生长抑制素比GDF-11低2， 500、5,000、7,500、8,000、9,000、9,500、9,700、9,800、9,900或10,000倍。在又一实施方式 中，较之与⑶F-11的结合，与肌肉生长抑制素结合的选择性为1，000、2,500、5,000、7,500、 8,000、9,000、9,500、9,700、9,800、9,900或10,000倍。在又一实施方式中，针对0^-11的1( (1 为10nM或更高，在又一实施方式中，其为25nM或更高，或者其为50nM、100nM、150nM、175nM或 180nM或更高。在又一实施方式中，较之结合至GDF-11而言结合至肌肉生长抑制素的选择性 为1，000、2,500、5,000、7,500、8,000、9,000、9,500、9,700、9,800、9,900或10,000倍。
[0117] 在又一实施方式中，本发明提供了具有实质上高于其针对GDF-11的结合亲和性的 针对肌肉生长抑制素的结合亲和性的抗原结合蛋白质。在一种实施方式中，抗原结合蛋白 质针对肌肉生长抑制素的亲和性是针对GDF-11的500倍高。在又一实施方式中，针对肌肉生 长抑制素的亲和性是针对GDF-11的1000倍高，或者其针对肌肉生长抑制素是针对GDF-11的 2,500、5,000、7,500、8,000、9,000、9,500、9,700、9,800、9,900或 10,000倍高。
[0118] 在又一方面，本发明提供了抑制肌肉生长抑制素的活性(例如，结合至肌肉生长抑 制素受体（或其亚单位）、结合至表达肌肉生长抑制素受体的细胞、或肌肉生长抑制素与 ALK4的结合)的抗原结合蛋白质。在一种实施方式中，抗原结合蛋白质具有ΙΟΟΟρΜ或更低的 IC5〇。在又一实施方式中，IC5Q为500pM或更低;在又一实施方式中，IC5Q为300pM或更低，或者 其为200pM或更低，或者其为ΙΟΟρΜ或更低。在又一实施方式中，IC 5Q与本文在实施例中描述 的抗体的IC5Q基本上相同。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质以与本文在实施例中描述的 抗体的IC5Q基本上相同的IC 5Q抑制肌肉生长抑制素的活性。
[0119] 在一种实施方式中，本发明的抗原结合蛋白质具有ΙΟΟΟρΜ或更低的针对肌肉生长 抑制素(或表达肌肉生长抑制素的细胞）的表观亲和性。在其它一些实施方式中，抗原结合 蛋白质展示出500pM或更低、300pM或更低、200pM或更低、ΙΟΟρΜ或更低、或80pM或更低的表 观亲和性。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质展示出与本文在实施例中描述的抗体的表 观亲和性基本上相同的表观亲和性。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质具有与本文在实 施例中描述的抗体的表观亲和性基本上相同的表观亲和性。
[0120] 在又一实施方式中，本发明提供了与本文公开的抗体竞争结合肌肉生长抑制素的 抗原结合蛋白质。此类竞争能力可通过本领域公知的方法来测定，例如通过使用荧光活化 细胞分选(FACS)技术或其他类似技术观察到的在结合表达肌肉生长抑制素的细胞中的竞 争、通过在检验例如B1 ACore?或K i nEx A?检验中的竞争、或通过在本文描述的另外 的检验中的竞争。在一个方面，与本文公开的抗体竞争结合肌肉生长抑制素的抗原结合蛋 白质与所述抗体结合相同的表位或者重叠(或附近)表位。在又一方面，与本文公开的抗体 竞争结合肌肉生长抑制素的抗原结合蛋白质抑制肌肉生长抑制素的活性。
[0121] 在又一方面，本发明提供了体外或体内（例如当施用给人受试者时)具有至少一天 半寿期的抗原结合蛋白质。在一种实施方式中，抗原结合蛋白质具有至少三天的半寿期。在 又一实施方式中，抗原结合蛋白质具有四天或更长的半寿期。在又一实施方式中，抗原结合 蛋白质具有八天或更长的半寿期。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质被衍生或被修饰，使 得其较之未经衍生或为经修饰的抗原结合蛋白质具有更长的半寿期。在又一实施方式中， 抗原结合蛋白质含有一处或多处点突变，以增加血清半寿期，例如2000年2月24日公开的TO 00/09560中描述的，其通过引用并入本文。
[0122] 本发明还提供了多特异性抗原结合蛋白质，例如双特异性抗原结合蛋白质，例如 通过两个不同抗原结合位点或区域结合肌肉生长抑制素的两个不同表位、或结合肌肉生长 抑制素的表位以及另一分子的表位的抗原结合蛋白质。此外，本文公开的双特异性抗原结 合蛋白质可包含来自本文所述的抗体之一的肌肉生长抑制素结合位点以及来自本文描述 的另外的抗体的第二肌肉生长抑制素结合区，包括本文通过引用其他公开文献而描述的那 些。或者，双特异性抗原结合蛋白质可包含来自本文描述的抗体之一的抗原结合位点以及 来自本领域已知的另外的肌肉生长抑制素抗体、或来自通过已知方法或本文描述的方法制 备的抗体的第二抗原结合位点。
[0123] 制备双特异性抗体的大量方法是本领域已知的，并被讨论于2001年4月20日提交 的美国专利申请〇9/839,632(通过引用并入本文）中。此类方法包括使用Milstein等，， 1983，Nature 305:537和其它（美国专利4,474,893、美国专利6，106,833)描述的杂交体-杂 交瘤，和化学偶联抗体片段（Brennan等，·，1985，Science 229 : 81;Glennie等，，1987， J. Immunol. 139: 2367;美国专利6，010，902)。此外，可通过重组手段来产生双特异性抗体， 例如通过使用亮氨酸拉链基元（即来自Fos和Jun蛋白质，其优先形成异源二聚体;Kostelny 等，，1992，J. Immnol. 148:1547)或其它锁匙相互作用结构域结构，如美国专利U. S. Patent 5,582,996所述。另外的有用技术包括上文Kortt et al. ,1997;美国专利5,959,083和美国 专利5,807,706中描述的那些。
[0124] 在又一方面，本发明的抗原结合蛋白质包含抗体的衍生物。衍生化抗体可包含向 抗体赋予想要的性质(例如特定用途中增加的半寿期）的任何分子或物质。衍生化的抗体可 包含例如可检测(或标记)基元(例如放射活性、发色、抗原性或酶分子、可检测珠粒(例如磁 性或电子致密(例如金)珠粒)或结合另外的分子的分子(例如生物素或链亲和素）），治疗性 或诊断性基元(例如放射活性、细胞毒性或药物活性基元)或增加抗体对于特定用途的适合 性(例如施用给受试者，例如人受试者，或者其它体内或体外用途）。可用于衍生化抗体的分 子的例子包括清蛋白（例如人血清清蛋白）和聚乙二醇(PEG)。抗体的连接清蛋白和PEG化的 衍生物可使用本领域公知的技术来制备。在一种实施方式中，抗体与转甲状腺蛋白质(TTR) 或TTR变体缀合或连接。可用例如选自右旋糖酐、聚(η-乙烯基吡咯烷酮）、聚乙二醇、聚丙二 醇均聚物、聚氧丙稀/聚氧乙稀共聚物、聚氧乙稀多元醇(polyoxyethylated polyols)和聚 乙烯醇构成的组的化学品修饰TTR或TTR变体。美国专利申请No .20030195154。
[0125] 本发明的另一方面包括本文描述的抗体的变体。某些变体被本文所述的共有序列 包括，例如SEQ ID NOs: 10和20中。另外的变体包括一个或多个氨基酸不同于本文公开的抗 体的抗体，例如，变体抗体的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨 基酸不同于公开的抗体序列。在有益实施方式中，变体与公开的抗体之一在氨基酸序列上 90 %相同。在又一实施方式中，变体抗体序列与本文公开的抗体之一91 %、92 %、93 %、 94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。变体还包括其中一个或多个氨基酸已被缺失的抗 体序列，例如一个、两个、三个、四个或五个氨基酸可从抗体多肽的末端缺失，或者此类缺失 可在内部进行。
[0126] 另外的实施方式也包括术语"抗体"中。例如，氨基酸残基可经历翻译后修饰，包括 但不限于，谷氨酰胺(特别是N-末端的谷氨酰胺)可被环化或转化为焦谷氨酸;此外或或者， 氨基酸可经历脱氨、异构化、糖化和/或氧化。本发明的多肽可经历额外的翻译后修饰，包括 糖基化，例如N-连接或0-连接的糖基化，其在本领域公知的位点进行。由此，可在多肽的氨 基酸序列中产生变化，以排除或最小化上述改变，或在此类加工是有益的情况下协助它们。
[0127] 在又一方面，本发明提供了使用本发明的抗原结合蛋白质筛选结合肌肉生长抑制 素的分子的方法。任何合适的筛选技术可以使用。在一种实施方式中，将本发明的抗原结合 蛋白质结合的肌肉生长抑制素分子或其片段与本发明的抗原结合蛋白质以及与另一分子 接触，其中所述另外的分子如果降低了抗原结合蛋白质与肌肉生长抑制素的结合的话，则 另外的分子结合肌肉生长抑制素。可使用任何合适的方法(例如ELISA)来检测抗原