如下所示： 以2%移动相B进行5分钟恒溶剂洗脱，接着是两段线性梯度洗脱，为从2%至50%移动相B进 行90分钟和从50 %至100 %移动相B进行5分钟。
[0187] CNBr、内切蛋白酶LysC和糜蛋白酶消化:
[0188] 用化学切割Met之后的肽键的CNBr、用切割赖氨酸之后的肽键的内切蛋白酶LysC 或用在?以、1'巧、1'印、1^11和把8之后切割的糜蛋白酶，消化成熟的人肌肉生长抑制素。对化 学切割而言，室温下在黑暗中在含有大约〇.5mg的CNBr的70%甲酸中孵育大约20-35微克的 人肌肉生长抑制素(〇.5mg/ml)16小时。对于蛋白酶切割而言，于37°C，使用20:1的肌肉生长 抑制素对蛋白酶比例（基于重量比重量）用LysC或糜蛋白酶在10mM乙酸铵(pH 6.5)中孵育 大约0.5mg/ml的20-35微克的人肌肉生长抑制素。对来自CNBr切割和蛋白水解消化实验的 1-3微克的量的样品进行LC-MS/MS肽图谱分析。还进行与ESI-MS检测离线的类似的肽图谱 分析，以收集各肽级分用于MALDI-MS分析和结合检验。
[0189] 在抗肌肉生长抑制素抗体保护实验中，于室温下将肌肉生长抑制素（20微克； 0.5mg/ml)与两种不同量(30和120微克;大致的肌肉生长抑制素二聚体/Ab摩尔比分别为4: 1和1:1)的抗体在〇 . 1M乙酸铵，pH 6.5中预孵育1小时。然后按照上文所述用LysC和糜蛋白 酶消化样品。相同浓度的抗体单独也被消化，并被用作为对照，因为少量抗体也可能被消 化。
[0190] TCEP[三(2-羧乙基)膦]还原:
[0191] 通过0.05%三氟乙酸中的100mM TCEP在37°C处理4小时，天然肌肉生长抑制素和 来自CNBr切割和LyxC消化样品的HPLC分离的胱氨酸结肽的二硫键被完全还原。然后使用与 LC-MS/MS肽图谱化相同的条件，通过LC-MS/MS分析来分析TCEP还原的样品。从与ESI-MS检 测离线的肽图谱分析来收集还原的肽。
[0192] CNBr 切割:
[0193] 对人肌肉生长抑制素的CNBr切割的HPLC色谱产生驻留时间分别为58和80分钟的 两个主峰。HPLC峰中的肽的身份被使用样品鉴定来测定，其被命名为肽B和C(表6)。肽B是产 生自Met84和MetlOl的切割的小片段。肽C比肽A洗脱早大约5分钟，未切割的肌肉生长抑制 素从对天然肌肉生长抑制素的HPLC分析回收。通过N-末端测序，MALDI-MS和LC-MS/MS分析， 肽C被鉴定为含有从1-80(分子量9022道尔顿)和102-109(分子量836道尔顿）的序列的胱氨 酸结片段。测定的肽C的分子量为大约19.7kD，这表明其为二聚体形式。对CNBr切割样品进 行TCEP还原接着进行HPLC肽图谱化之后，收集表6所示的肽D和E。在58分钟的驻留时间洗脱 的肽D被鉴定为具有与肽B相同的序列;在80分钟洗脱的肽E被鉴定为含有1-80序列，表明在 序列位置102-109连接至肽的二硫键以及分子间二硫键已经被完全还原。
[0194] LysC 消化:
[0195] 对LysC消化物的HPLC色谱仅产生四个峰。在8和38分钟驻留时间的肽峰被鉴定为 是具有分别被指为位置37-39和91-97的序列的肽。这两个肽峰没有被收集进行结合检验。 在61分钟收集的肽F具有被指为79-90的序列(表2)。如N-末端测序和MALDI-MS所证实的，在 76分钟收集的肽G含有通过二硫键连接的四条序列，并被指为1-36、40-54、55-78和98-109， 这表明胱氨酸结结构是完整的。该肽峰被测定为具有19.5kD的分子量，这证实了二聚体形 式的存在。四个肽中具有二硫键的肽G的一级结构显示于图4。
[0196] 在LysC消化物的TCEP还原之后进行LC-MS/MS肽图谱化，然后收集六条肽，进行进 一步分析(表6)。38分钟的肽H，如上文所述的不含半胱氨酸的肽，含有序列91-97。在43、49、 60和79分钟收集的肽I、J、K和Μ被指为分别处于下述序列位置--55-78、98-109、40-54和 1-36。这些肽清楚地源于肽G的TCEP还原。在73分钟的肽L含有混合的序列，没对其进行序列 指认。
[0197] 在抗体保护实验中（其中用两种不同抗体浓度的抗体预孵育的肌肉生长抑制素被 LysC蛋白质水解），从这些实验获得的肽图谱与从仅对肌肉生长抑制素消化获得的那些相 同。在78分钟的主峰的结构与肽G-一描述的LysC胱氨酸-结肽完全相同。数据显示，12A5-5 对于肌肉生长抑制素蛋白质水解不具有保护作用，即，抗体在LysC消化期间不提供蛋白质 水解保护。 _8] 糜蛋白酶消化:
[0199] 对糜蛋白酶消化物的HPLC色谱产生了多个峰。在从HPLC回收的肽峰上进行序列分 析。还进行了对肽消化物的在线ESI LC-MS分析，以测定通过HPLC分离的肽的精确质量。糜 蛋白酶切割产生了大量的肽峰，其中含有在驻留时间27.1分钟（序列位置53-57和53-59)、 29分钟(序列位置30-31)、32· 3分钟(序列位置52-57)、41分钟(序列位置53-60)、44分钟(序 列位置52-60)、50分钟（序列位置87-95)、53分钟（序列位置30-38)、57分钟（序列位置28-31)和58分钟（序列位置21-27)检测到的短的从二肽到七肽。大约67-73分钟的大分子量和 宽肽峰(命名为肽N)被鉴定为含有胱氨酸结结构，通过N-末端测序证实其由四个肽构成(序 列位置1-20、25-38、39-82和96-109)。]\^〇)1-]^分析表明，肽~具有14.41^的分子量，这验证 了二聚体的存在，而对二硫键进行的来源中MALDI(MALDI-in-source)部分片段化证实了肽 峰含有对应于图5所示的序列位置的预期分子量的四个肽。
[0200] 在抗体保护实验中（其中用糜蛋白酶对经12A5-5预孵育的肌肉生长抑制素进行蛋 白质水解并通过LC-MS/MS肽图谱化进行分析），在低抗体摩尔比例下，在肽图谱化期间，对 应于序列位置30-31和28-31和32-38的肽的肽峰显示出其分别的UV吸光度检测信号的减 少，这表明具有位置28和38之间的序列的肽易于被抗体保护免受糜蛋白酶消化。抗体对肌 肉生长抑制素的高摩尔比例（接近1:1)下，大部分蛋白质水解位点被保护。针对序列位置 21-27、30、31、28-31、32-38和52-60的肽观察到了显著的肽峰减少，针对肽87-95观察到了 轻微的减少。作为结果，观察到具有高UV吸光度的75分钟处的新的峰(表6中的肽P)。这些数 据表明，肌肉生长抑制素中的两个区域(位于位置21-31和位置50-60附近的序列)与抗体紧 密相互作用，从而防止在上述肽的肽键进行的糜蛋白酶切割，因此他们对于12A5-5对肌肉 生长抑制素的结合来说是必需的。
[0201 ]表6分离自对来自CNBr、内切蛋白酶LysC和糜蛋白酶消化的消化物的HPLC肽图谱 分析的肌肉生长抑制素肽 [0202]
[0203] BIAcore? 结合检验:
[0204] 用于表征被抗肌肉生长抑制素中和单克隆抗体结合的表位的测量是使用多种 CNBr-、LysC-和糜蛋白酶-产生的人肌肉生长抑制素肽并且测定哪些肽能被抗体结合。在一 个方面，这在BIAeore?竞争结合检验中测试，其中在存在或不存在多种分离的HPLC肽级 分中的每种的情况下，测定12A5-5与固定到BIAcore?芯片上的人肌肉生长抑制素的结 合。不存在任何竞争性肽时，12A5-5能结合芯片上的人肌肉生长抑制素并且产生RU(共振单 位)应答。将12A5-5与溶液中的完整人肌肉生长抑制素预孵育接着测试与芯片的结合，其表 明，抗体与溶液中的人肌肉生长抑制素的结合防止了抗体与芯片上的人肌肉生长抑制素的 结合，由此确证了竞争检验的一般原则。该一般流程针对每种抗体分别重复。强烈的RU应答 表明测试的特定肽不能结合溶液中的12A5-5(因此12A5-5游离以结合没有固定到芯片上的 人肌肉生长抑制素）。相反，不存在强烈的RU应答则表明12A5-5能结合溶液中的肌肉生长抑 制素肽(并且由此不能结合被固定的肌肉生长抑制素）。这些结合模式联合多种肌肉生长抑 制素肽的已知身份被用于确定肌肉生长抑制素的哪些区域对于抗体12A5-5的结合来说是 重要的(或必需的）。
[0205]图6总结了对于未经还原的和TCEP还原的肽样品的结合检验。基于EM Acore?竞 争性检验，肽A(从HPLC回收的肌肉生长抑制素二聚体）、肽C(含有胱氨酸结二聚体的CNBr 肽）、肽E(还原的CNBr肽，序列位置1-80)、肽0(还原的完整肌肉生长抑制素单体;序列位置 1-109)，肽G(含有胱氨酸结二聚体的LysC肽，序列位置1-36、40-54、55-78&98-109)和肽P (抗体保护的糜蛋白酶解肽，含有胱氨酸结二聚体，序列位置1-20、21-82&96-109)全部均可 结合抗体。肽N(糜蛋白酶解肽，含有胱氨酸结二聚体，序列位置1-20、39-51、63-82&96-109) 不能结合抗体，测试的任何其他肽也不能，包括从对肽G的TCEP还原获得的那些。此外，对于 含有在抗体保护检验中鉴定为涉及结合的序列的肽Μ来说也是这样，这表明氨基酸21至31 之间的区域是对12Α5-5与肌肉生长抑制素的结合来说必需但不足够的。
[0206] 12Α5-5结合肽A、C、E和G的能力在直接结合分析中被进一步证实，其中肽被共价固 定以在B丨Acore?芯片上形成肽表面。对该实验而言，将2 5nM的抗体以80微升/分钟的速 度在2.5分钟内流经肽表面，接着流动缓冲液15分钟。图7显示了分析的传感图。抗体结合被 固定的肽的结合相在~200s结束，这是抗体从表面的解离相的起点。肽A、C、E和肌肉生长抑 制素的平坦的解离相表明了抗体与这些肽键的稳定复合体的形成，而在肽G表面上的解离 相的信号减少则表明在抗体和肽G之间形成的复合体较不稳定。将肽G与肽C进行比较，抗 体/肽G复合体稳定性的减少看起来较大，这是由于在肽G的K54进行的LysC切割造成的（图 4)，而在肽C的氨基酸50至60附近的区域中没有CNBr切割（其丢失了M78和M101之间的片 段)。
[0207]值得注意的是，肌肉生长抑制素恰在K54之前的序列是EFVFLQ，而⑶F11中对应的 序列是EYMFMQ。在以前的实验中，肌肉生长抑制素中的该区域被来自GDF11的相应区域替换 显著减少了嵌合分子与抗体的相互作用。本发明的数据表明，在肌肉生长抑制素中该区域 周围的切割还降低了其与12A5-5抗体形成复合体的能力，虽然这并不完全消除它。考虑到 12A5-5与肌肉生长抑制素的结合亲和性大约为2pM，而针对GDF11为大约180nM，因此该区域 看起来对于抗体与肌肉生长抑制素的特异性结合来说是必需的。
[0208]将上述数据考虑到一起，肌肉生长抑制素中对于肌肉生长抑制素和抗肌肉生长抑 制素中和抗体12A5的结合来说必需的区域位于位置21至31和位置50至60附近的序列（如图 8所示）。这两个区域看起来在一级序列水平上相聚较远。但是，它们在二聚体形式的三维结 构上被带到一起，如肌肉生长抑制素/卵泡抑素复合体的共结晶结构所证实的（上文Cash)。 图8显示了三维肌肉生长抑制素二聚体和单体结构，其中每个肌肉生长抑制素单体形成典 型的胱氨酸结结构。两个单体互相反平行并且形成具有两个单体之间的Cys73-C ys73二硫 键的肌肉生长抑制素二聚体。肌肉生长抑制素二聚体的反平行结构使得来自一个单体的 L52/L60附近的区域与另一单体中F27/W31附近的区域紧密接近。上述数据表明抗体12A5-5 需要这两个区域二者来实现其强结合活性。
【主权项】
1. 一种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，所述抗体包含至少一条轻链和至少一条重 链，其中所述轻链包含恒定区和含有三个互补性决定区（CDRs)的可变区，并且所述重链包 含恒定区和含有三个互补性决定区（⑶Rs)的可变区，其中所述轻链⑶Rs是SEQIDNO: 10中 公开的那些，并且所述重链⑶Rs是SEQIDN0:20中公开的那些。2. 权利要求1所述的抗体，其中所述轻链CDRs选自 a)SEQIDN0:1中公开的轻链CDRs; b)SEQIDN0:2中公开的轻链CDRs; c)SEQIDNO:3中公开的轻链CDRs; d)SEQIDN0:4中公开的轻链CDRs; e)SEQIDNO:5中公开的轻链CDRs; f)SEQIDN0:6中公开的轻链CDRs; g)SEQIDNO:7中公开的轻链CDRs; h)SEQIDN0:8中公开的轻链CDRs;和 i)SEQIDNO:9中公开的轻链CDRs 构成的组； 并且其中所述重链⑶Rs选自 a'）SEQIDNO: 11中公开的重链CDRs; b'）SEQIDN0:12中公开的重链CDRs; c'）SEQIDN0:13中公开的重链CDRs; d'）SEQIDN0:14中公开的重链CDRs; e'）SEQIDN0:15中公开的重链CDRs; f'）SEQIDNO:16中公开的重链CDRs; g'）SEQIDN0:17中公开的重链CDRs; h'）SEQIDN0:18中公开的重链CDRs;和 i'）SEQIDN0:19中公开的重链CDRs 构成的组。3. 权利要求1所述的抗体，其中所述轻链可变区包含SEQIDNO: 10中示出的氨基酸序 列，所述重链可变区包含SEQIDN0:20中示出的氨基酸序列。4. 权利要求3所述的抗体，所述轻链可变区选自 a)SEQIDN0:1中公开的轻链可变区； b)SEQIDN0:2中公开的轻链可变区； c)SEQIDNO:3中公开的轻链可变区； d)SEQIDN0:4中公开的轻链可变区； e)SEQIDNO:5中公开的轻链可变区； f)SEQIDN0:6中公开的轻链可变区； g)SEQIDNO:7中公开的轻链可变区； h)SEQIDN0:8中公开的轻链可变区；和 i)SEQIDN0:9中公开的轻链可变区 构成的组； 并且其中所述重链可变区选自 a'）SEQIDNO: 11中公开的重链可变区； b'）SEQIDN0:12中公开的重链可变区； c'）SEQIDN0:13中公开的重链可变区； d'）SEQIDN0:14中公开的重链可变区； e'）SEQIDN0:15中公开的重链可变区； f·'）SEQIDN0:16中公开的重链可变区； g'）SEQIDN0:17中公开的重链可变区； h'）SEQIDN0:18中公开的重链可变区；和 i'）SEQIDN0:19中公开的重链可变区 构成的组。5. -种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，所述抗体以小于ΙΟΟρΜ的Kd结合肌肉生长抑 制素。6. 权利要求5所述的分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，所述抗体以高于1OnM的Kd结合 GDF-ll〇7. -种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，所述抗体以其针对GDF-11的亲和性至少 5000倍的亲和性结合肌肉生长抑制素。8. -种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，所述抗体展示出针对肌肉生长抑制素的选 择性，所述选择性是针对GDF-11的至少5000倍。9. 一种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，所述抗体结合肌肉生长抑制素并且阻碍肌 肉生长抑制素与ALK4的相互作用。10. 权利要求9所述的分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，所述抗体结合肌肉生长抑制 素并阻碍肌肉生长抑制素与ALK4的相互作用，但是与肌肉生长抑制素/ActRIIA复合体和/ 或肌肉生长抑制素/ActRIIB复合体共结合。11. 一种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，所述抗体结合肌肉生长抑制素，其中肌肉 生长抑制素中肌肉生长抑制素与所述肌肉生长抑制素特异性拮抗剂的结合所需的两个区 域位于成熟肌肉生长抑制素(SEQIDN0:25)的第21至31位和第50至60位附近的序列。12. -种分离的肌肉生长抑制素特异性抗体，所述抗体与肌肉生长抑制素中位于成熟 肌肉生长抑制素的第21至31位和第50至60位附近的序列的两个区域相互作用，以防止对这 些区域内肽键的糜蛋白酶切割。13. 权利要求1-12中任意一项所述的抗体，其中所述轻链恒定区选自κ轻链和λ轻链构 成的组，并且所述重链恒定区选自μ重链恒定区、S重链恒定区、γ重链恒定区、α重链恒定区 和ε重链恒定区构成的组。14. 权利要求13所述的抗体，其中所述抗体属于选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4构成的组 的亚类。15. -种分离的核酸，其编码根据权利要求1-14中任意一项所述的肌肉生长抑制素特 异性拮抗剂。16. -种包含权利要求15所述的核酸的载体。17. -种经权利要求16所述的抗体转染或转化的分离的宿主细胞。18. -种用于生产肌肉生长抑制素特异性拮抗剂的方法，所述方法包括在促进表达的 条件下培养权利要求17的宿主细胞以及从培养基中回收所述肌肉生长抑制素特异性拮抗 剂。19. 一种组合物，其包含权利要求1-16中任意一项所述的肌肉生长抑制素特异性拮抗 剂和生理上可接受的稀释剂、赋形剂或载剂。20. -种抑制肌肉生长抑制素的至少一种活性的方法，所述方法包括将根据权利要求 19所述的组合物施用至个体，使得肌肉生长抑制素的至少一种活性被部分或完全抑制。21. 权利要求20所述的方法，其中所述个体患有选自下述病况构成的组的病况:性功能 减退(包括雄激素剥夺疗法导致的性功能减退，和年龄相关的性腺机能减少导致的性功能 减退），恶病质；心源性恶病质；肾源性恶病质，心脏萎缩;心发育不良；心衰;肌肉减少症;外 伤性骨折;骨质疏松性骨折;骨损失（例如骨质疏松症或骨质减少）；阿狄森氏病;肌萎缩性 侧索硬化或运动神经元病(ALS;MND;卢格里格病）；贝尔麻痹(和/或面部神经问题）；肉毒杆 菌中毒;脑性麻痹;进行性神经性腓骨肌萎缩症和其它外周神经病;库欣综合征;糖尿病性 神经病;格林-巴利综合征;多发性硬化;肌萎缩(包括进行性肌萎缩和脊髓性肌萎缩）；肌营 养不良症(包括Becker型肌营养不良，先天性肌营养不良，Duchenne型肌营养不良，远端型 肌营养不良，Emery-Dreifuss型肌营养不良，面肩肱型肌营养不良症，肢带型肌营养不良 症，强直性肌营养不良症，眼咽型肌营养不良，脊髓性肌萎缩，Brown-Vialetto-VanLaere 综合征(BVVL)、Fazi〇-Londe(FL)综合征和特征在于进行性骨骼肌无力的其它综合征，肌肉 蛋白质中的缺陷，以及肌肉细胞和组织的死亡）；重症肌无力;脊髓灰质炎；多肌炎;肌肉、肌 腱和/或韧带的扭伤和拉伤；中风(和其他导致肌肉消耗的病况，例如长期不活动或卧床，肢 固定(例如通过打石膏和/或上夹板)和太空飞行）；和可通过生长激素、胰岛素生长因子-1 (IGF-1)、生长激素促分泌素和与激素-IGF-1轴相关的其他试剂治疗的病况。
【专利摘要】本发明公开了选择性肌肉生长抑制素拮抗剂(包括抗体)、编码它们的核酸以及制造和使用它们的方法。还公开了识别第21至31位附近和第50至60位附近的构象表位的中和抗体。
【IPC分类】A61P9/00, C12N15/13, A61P25/02, A61P19/10, C07K16/22, A61P25/00, A61P15/00, C12P21/02, A61P39/02, A61P19/08, A61P37/02, A61P21/04, A61P21/00, A61P9/04, A61K39/395
【公开号】CN105440134
【申请号】CN201510954088
【发明人】韩汇泉, T·阿罗拉, 陈清, 卢瀗鍹, 周小岚
【申请人】安姆根公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2011年8月15日
【公告号】CA2808382A1, CN103221426A, CN103221426B, EP2606066A1, US8999343, US20130209489, US20150322144, WO2012024242A1