171，785中有述。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的猝 灭剂为DABCYL和TAMRA。常用的暗猝灭剂包括BlackHole Quenchers ? (BHQ)(Biosearch Technologies , Inc ., Novato , Cal.)nIowa Black?(Integrated DNA Tech., Inc ., Coralville, Iowa)NBlackBerry? Quencher 650(BBQ-650)(Berry & Assoc., Dexter, Mich. )〇
[0045] 可以使用，例如，光子计数落射荧光显微镜系统(包含用于在特定范围监测荧光发 射的合适的分色镜与滤光器）、光子计数光电倍增系统或荧光计来进行荧光分析。可使用氩 离子激光器、高强度汞(Hg)弧光灯、光纤光源或针对在所需范围内的激发经适当过滤的其 它高强度光源来进行激发以引发能量转移。
[0046] 如本文中所用，在谈到供体和对应的受体荧光部分时，"对应的"指代受体荧光部 分具有与供体荧光部分的激发光谱重叠的发射光谱。受体荧光部分发射光谱的最大波长应 当比供体荧光部分激发光谱的最大波长大至少1〇〇 nm。因此，它们之间可以产生有效率的 非辐射能量转移。
[0047] 对荧光供体和对应的受体部分的选择通常是根据(a)高效率的Forster能量转移； (b)大的最终Stokes位移(>100 nm);(c)向可见光谱红色部分(>600 nm)尽可能远的发射位 移；以及(d)发射位移至比通过供体激发波长激发所产生的Raman水荧光发射更高的波长。 例如，可选择这样的供体荧光部分，所述供体荧光部分具有在激光谱线附近(例如，氦-镉 442 nm或氩488 nm)的其最大激发、高消光系数、高量子产率以及其荧光发射与对应的 受体荧光部分的激发光谱的良好重叠。可选择这样的对应的受体荧光部分，所述受体荧光 部分具有高消光系数、高量子产率、其激发与供体荧光部分的发射的良好重叠以及可见光 谱的红色部分(>600 nm)中的发射。
[0048]可在FRET技术中与各种受体荧光部分一起使用的代表性的供体荧光部分包括荧 光素、焚光黄、B-藻红蛋白、9-异硫氰酸吖啶酯(acridine isothiocyanate )、焚光黄VS、4_乙 酰胺基-4'-异硫氰酸芪-2,2'_二磺酸、7-二乙胺基-3-(4'_异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素、 1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯以及4-乙酰胺基-4'-异硫氰酸芪_2,2'_二磺酸的衍生物。代表性的 受体荧光部分(取决于所用供体荧光部分)包括LC Red 640、LC Red 705、075、075.5、丽丝 胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明异硫氰酸四甲基酯、罗丹明X异硫氰酸酯、赤藓红异硫氰酸酯、荧 光素、二乙烯三胺五乙酸酯或其它镧系元素离子(例如，铕或铽)的螯合物。供体和受体荧光 部分可得自，例如，Molecular Probes(Junction City, Oreg.)或Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.)〇
[0049] 可通过连接臂将供体和受体荧光部分连接至合适的探针寡核苷酸。每个连接臂的 长度很重要，因为连接臂将影响供体和受体荧光部分之间的距离。用于本公开的目的的连 接臂的长度为从核苷酸碱基到荧光部分的距离（以埃(A)计）。一般来讲，连接臂为约?ο A至 约25 A。连接臂可以是W0 84/03285中所述的那种。W0 84/03285还公开了用于将连接臂连 接至特定核苷酸碱基，以及还用于将荧光部分连接至连接臂的方法。
[0050] 可将受体荧光部分(如LC Red 640-NHS-酯）与C6-亚磷酰胺(可得自ABI (Foster City, Calif.)或Glen Research (Sterling, Va·))结合以产生，例如，LC Red 640-亚磷 酰胺。经常用到的将供体荧光部分(如荧光素)偶联至寡核苷酸的接头包括硫脲接头(FITC 衍生的，例如，来自Glen Research或ChemGene (Ashland, Mass.)的焚光素-CPG)、酰胺接 头（焚光素-NHS-酯衍生的，如来自BioGenex (San Ramon, Calif.)的焚光素-CPG)或需要 在寡核苷酸合成后偶联焚光素-NHS-酯的3 氨基-CPG。
[0051 ] 检测靶核酸中的SNP 本公开提供了用于检测生物制品中靶核酸的SNP存在与否的方法。所提供的方法避免 了样品污染、假阴性和假阳性的问题。方法包括进行至少一个循环步骤和荧光检测步骤，所 述循环步骤包括使用引物对从样品扩增靶核酸分子的一部分，所述荧光检测步骤使用具有 偏向3'端的发夹结构的水解探针。可优选地在热循环仪中进行多个循环步骤。可使用引物 和探针实施所述方法以检测样品中靶核酸的SNP的存在。
[0052]如本文中所述，可使用利用FRET技术的经标记的水解探针检测扩增产物。一种 FRET方式使用TaqMan ?技术以检测扩增产物的存在与否，并从而检测靶核酸中SNP的存在 与否。TaqMan?技术使用一种经两个荧光部分标记的单链杂交水解探针。当第一荧光部分 由合适波长的光激发时，所吸收的能量根据FRET原理被转移至第二荧光部分。第二荧光部 分通常为猝灭剂分子。在PCR反应的退火步骤期间，经标记的杂交探针结合至靶DNA(即，扩 增产物)并在后续的延伸阶段通过Taq聚合酶的5 '至3 '核酸外切酶活性被降解。因此，经激 发的荧光部分和猝灭剂部分在空间上变得彼此分离。作为结果，当在猝灭剂不存在的情况 下激发第一荧光部分时，则可以检测到来自第一荧光部分的荧光发射。举例来说，ABI PRISM? 7700序列检测系统(Applied Biosystems)使用TaqMan?技术，并且适用于实施 本文中所述的用于检测样品中靶核酸的SNP存在与否的方法。
[0053] 一般来讲，存在FRET表明样品中靶核酸存在SNP，而不存在FREI1则表明样品中不存 在HSV-1和/或HSV-2。然而，标本采集不足、运输延误、不恰当的运输条件或使用某些采集拭 子(藻酸钙或错柄(aluminum shaft))均是可以影响测试结果的成功和/或准确度的条件。 使用本文所公开的方法，在例如，45个循环步骤之内检测到FRET表明样品中靶核酸存在 SNP〇
[0054] 可用于实践本发明的方法的代表性的生物样品包括但不限于皮肤拭子、鼻腔拭 子、伤口拭子、血液培养物、皮肤和软组织感染物(soft tissue infection)。采集和保存生 物样品的方法是本领域技术人员已知的。生物样品可进行处理(例如，通过本领域已知的核 酸提取方法和/或试剂盒）以释放靶核酸，或在一些情况下，生物样品可以与PCR反应组分以 及合适的寡核苷酸直接接触。
[0055] 在热循环仪的每次运行中，对照样品也可以被循环。阳性对照样品可以使用，例 如，对照引物和对照探针扩增靶核酸对照模板(而非所述的靶基因的扩增产物）。阳性对照 样品还可以扩增，例如，含有靶核酸分子的质粒构建体。此类质粒对照可以内部扩增(例如， 在样品内）或在单独的样品中与患者样品并排运行。热循环仪的每次运行还可以包含阴性 对照，例如，其缺乏靶模板DNA。此类对照是扩增、杂交和/或FRET反应成功与否的指标。因 此，对照反应可容易地确定，例如，引物序列特异性地退火和起始延长的能力以及探针序列 特异性地杂交和进行FRET的能力。
[0056]在一个实施方案中，本发明的方法包括避免污染的步骤。例如，在美国专利号5， 035，996、5，683，896和5，945，313中描述了使用尿嘧啶DNA糖基化酶的酶促方法以减少或消 除热循环仪的一次运行与下一次之间的污染。
[0057]结合了FRET技术的常规PCR方法可用于实践本发明的方法。在一个实施方案中，使 用了LightCycler ?仪器。下列专利申请描述了如LightCycler ?技术中所用到的实时PCR: WO 97/46707、W0 97/46714和W0 97/46712。
[0058] LightCycler ?可以使用PC工作站进行操作并且可以使用Windows NT操作系统。 当机器将毛细管依次置于光学元件上方时获取来自样品的信号。软件可以在每次测量后立 刻实时显示荧光信号。荧光采集时间为10-100毫秒(msec)。在每个循环步骤之后，可持续更 新所有样品的相对于循环次数的荧光定量显示。生成的数据可以被保存用于进一步分析。 [0059]应当理解，本发明的实施方案不为一种或多种市售仪器的配置所限。
[0060]制品/试剂盒 本公开还提供了制品或试剂盒以检测靶核酸的SNP。制品可包括用于检测SNP的引物和 探针，连同合适的包装材料。用于检测SNP的代表性的引物和探针能够杂交至靶核酸分子。 此外，试