剂盒还可包括用于DNA固定、杂交和检测所需的适当包装的试剂和材料，如固体支 持物、缓冲液、酶和DNA标准品。本文中公开了设计引物和探针的方法，并提供了扩增和杂交 靶核酸靶核酸分子中SNP的引物和探针的代表性的实例。
[0061 ]本发明的制品还可以包括用于标记探针的一种或多种荧光部分或，可选地，可以 标记试剂盒所提供的探针。例如，制品可包括用于标记SNP特异性探针的供体和/或受体荧 光部分。上文提供了合适的FRET供体荧光部分和对应的受体荧光部分的实例。
[0062] 制品还可包括包装说明书或其上带有说明书的包装标签用于使用引物和探针以 检测样品中靶核酸的SNP。制品可额外包括用于实施本文所公开方法的试剂(例如，缓冲液、 聚合酶、辅因子或防止污染的试剂）。此类试剂可专用于本文所述的市售仪器之一。
[0063] 将在以下实施例中进一步描述本发明的实施方案，其不会限制权力要求书中所述 的本发明的范围。 实施例
[0064] 提供了以下实施例和图表以帮助理解本发明，其真实范围描述于所附权利要求书 中。应当理解，可在所描述的程序内做出修改而不脱离本发明的精神。
[0065] 实施例1 MTB-RIF TaqMan? SNP 检测 结核病(TB)是一种严重的肺部疾病，其通常由结核分枝杆菌(MTB)或MTB复合物的其它 成员所引起。MTB的耐药菌株日渐增多，并且一种特别危险的耐药结核病形式为耐多药结核 病(MDR-TBXMDR-TB被定义为对至少两种最常用的抗结核药物(利福平和异烟肼)发展出耐 药性的MTB。大约83-87%的利福平耐药性是由编码RNA聚合酶的β亚基的rpoB基因的81个碱 基对的利福平耐药性决定区(RRDR)内的单核苷酸多态性造成的。
[0066] 突变体特异性TaqMan ?水解探针被设计成具有5'端荧光团和内部猝灭剂。除此以 外，在探针的3'端引入了额外的一个或多个碱基，其将导致偏向3'端的发夹结构。设计探针 使得WT和MT间的错配位于报告基因和靠近5'端的猝灭剂之间。当TaqMan?探针完整时，报 告基因和猝灭剂彼此离得很近，这会防止任何荧光的发射。
[0067] 在PCR过程中，在变性后，引物和TaqMan?探针退火至互补的DNA链。杂交后并在 PCR延伸阶段期间，DNA聚合酶的5'至3'核酸外切酶活性切割探针，这使报告基因和猝灭剂 染料(quencher dye)分离并检测到荧光。靠近探针的3'端的发夹结构会延缓探针的3'一半 与模板的杂交，并因而有助于根据单个碱基对的差异或错配来区分WT和MT靶标。相比WT模 板，MT发夹TaqMan ?探针的5 '一半将更有效率地杂交至MT质粒DNA模板。当MT特异性探针发 现WT靶标时，与WT靶标的单个错配将防止杂交和探针切割，并不会检测到荧光。
[0068] 材料和方法 DNA靶标-野生型(WT)和突变型(MT)质粒 MT和WT质粒DNA:所测试的投入量在le6 cp/PCR至10 cp/PCR的范围内，示于表1中，其 显示了结核分枝杆菌中rpoB基因的利福平耐药性决定区(RRDR)的一部分。
[0069] 表1:野生型和突变型质粒DNA
[0070] MTB特异性寡核苷酸:用于野生型和突变型质粒两者的一组正向和反向引物 示于表1I中的突变型特异性发夹TaqMan ?探针 表1I:具有和不具有发夹结构的SNP特异性探针
[0071] 名称:F代表Thre〇-FAM;P代表磷酸;Q代表BHQ-2猝灭剂;而粗体并加下划线的字母 是经改变或被添加以形成发夹的碱基。
[0072] 平台：LightCycler? 480系统 使用一组正向和反向引物以及具有3 '端发夹结构的TaqMan ?探针进行实时PCR扩增。 以Ie6、le2、le3和lei cp/PCR测试野生型或突变型质粒DNAJCR反应体积为50 yL，并在下 文中列出了主混合物组分和温度概况条件。在LC480平台上进行扩增并使用ATF数据分析软 件分析了 PCR生长曲线。结果示于图1至8中。
[0073] 虽然出于清楚和理解的目的较为详细地描述了上述发明，但是通过阅读本公开， 本领域技术人员将清楚，可在形式和细节上做出各种变化而不脱离本发明的真实范围。例 如，上述所有技术和装置可以各种组合使用。
【主权项】
1. 用于检测样品中靶核酸的单核苷酸多态性(SNP)的方法，所述方法包括： -进行扩增步骤，包括使所述样品与包含第一核酸序列的引物接触，从而当所述样品 中存在任何靶核酸时，产生扩增产物； -进行杂交步骤，包括使所述扩增产物与包含第二核酸序列的SNP特异性水解探针接 触，所述第二核酸序列与所述扩增产物的含有SNP的区域互补，所述SNP特异性水解探针包 含第一和第二可相互作用的标记、5'端和3'端以及偏向3'端的发夹结构，所述发夹结构包 含含有一个或多个非天然存在的核苷酸的非天然存在的核酸序列区域以产生所述发夹结 构；以及 -检测所述扩增产物存在与否，其中存在所述扩增产物表明在所述靶核酸靶标中存在 SNP，而其中不存在所述扩增产物表明在所述靶核酸靶标中不存在SNP。2. 根据权利要求1的方法，其中所述第一可相互作用的标记包含处于5'末端的供体荧 光部分，并且所述第二可相互作用的标记包含在水解探针上所述供体荧光部分的不超过5 个核苷酸之内的对应的受体荧光部分。3. 根据权利要求2的方法，其中所述受体荧光部分为猝灭剂。4. 根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述扩增采用具有5'至3'核酸外切酶活性 的聚合酶。5. 根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述引物的所述第一核酸序列和/或所述 水解探针的所述第二核酸序列包含至少一个经修饰的核苷酸。6. 根据权利要求1至5中任一项的方法，其中所述引物的所述第一核酸序列和/或所述 水解探针的所述第二核酸序列具有40个或更少的核苷酸。7. 用于检测样品中靶核酸的SNP的试剂盒，其包含： -至少一种引物，其包含特异性产生所述靶核酸的扩增产物的第一核酸序列;和 -SNP特异性水解探针，其包含与所述扩增产物的含有SNP的区域互补的第二核酸序 列，所述SNP特异性水解探针包含第一和第二可相互作用的标记、5'端和3'端以及偏向3'端 的发夹结构，所述发夹结构包含含有一个或多个非天然存在的核苷酸的非天然存在的核酸 序列区域以产生所述发夹结构。8. 根据权利要求7的试剂盒，其中所述第一可相互作用的标记包含处于5'末端的供体 荧光部分，并且所述第二可相互作用的标记包含在水解探针上所述供体荧光部分的不超过 5个核苷酸之内的对应的受体荧光部分。9. 根据权利要求8的试剂盒，其中所述受体荧光部分为猝灭剂。10. 根据权利要求7至9中任一项的试剂盒，其还包含具有5'至3'核酸外切酶活性的聚 合酶。11. 根据权利要求7至10中任一项的试剂盒，其中所述引物的所述第一核酸序列和/或 所述水解探针的所述第二核酸序列包含至少一个经修饰的核苷酸。12. 根据权利要求7至11中任一项的试剂盒，其中所述引物的所述第一核酸序列和/或 所述水解探针的所述第二核酸序列具有40个或更少的核苷酸。 13. SNP特异性水解探针，其包含与扩增产物的含有SNP的区域互补的核酸序列，所述 SNP特异性水解探针包含第一和第二可相互作用的标记、5'端和3'端以及偏向3'端的发夹 结构，所述发夹结构包含含有一个或多个非天然存在的核苷酸的非天然存在的核酸序列区 域以产生所述发夹结构。14. 根据权利要求13的SNP特异性水解探针，其中所述第一可相互作用的标记包含处于 5'末端的供体荧光部分，并且所述第二可相互作用的标记包含在水解探针上所述供体荧光 部分的不超过5个核苷酸之内的对应的受体荧光部分。15. 根据权利要求14的SNP特异性水解探针，其中所述受体荧光部分为猝灭剂。16. 根据权利要求13至15中任一项的SNP特异性水解探针，其中所述水解探针的所述核 酸序列包含至少一个经修饰的核苷酸。17. 根据权利要求13至16中任一项的SNP特异性水解探针，其中所述水解探针具有40个 或更少的核苷酸。
【专利摘要】描述了用于快速检测样品中靶核酸的SNP存在与否的方法。所述方法可包括进行扩增步骤、使用包含偏向3ˊ端的发夹结构的SNP特异性水解探针的杂交步骤以及检测步骤。此外，提供了包含偏向3ˊ端的发夹结构的SNP特异性水解探针连同设计用于检测靶核酸的SNP的试剂盒。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105579591
【申请号】CN201480053676
【发明人】R.梅塔
【申请人】豪夫迈·罗氏有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2014年12月11日
【公告号】CA2925212A1, US9297033, US20150167059, WO2015086721A1