险。在复发时(N= 38) (A)、在无复发患者(N= 189)和最终复发的患者(N=65)的复发前 时期(B)、在无复发患者(N=189)和复发患者(N=103)的任何时刻(C)具有正分(DNA甲基化 评分经计算高于阔值）的尿沉淀物的百分比，W及在同一临床访视时与细胞学和膀脫镜检 报告的比较。饼状图概述了在复发前时期（B)或在任何时刻（C)的所有样品（左）或患者 (右）。患者水平的正分代表了任何合格的访视时DNA甲基化正分的历史。样品水平图报告了 来自无复发患者的样品在DNA甲基化阴性样品中的百分比（阴性预测比例，NPF似及来自复 发患者的样品在DNA甲基化阳性样品中的百分比（阳性预测比例；PPF);患者水平图报告了 无复发患者在无阳性样品史的患者中的百分比（阴性预测值，NPV)和复发患者在具有DNA甲 基化阳性样品史的患者中的百分比（阳性预测值，PPV)。还报告了在运些相同的样品组/患 者组中细胞学和膀脫镜检的表现。
[0037] 图5显示了 DNA甲基化变化可W在膀脫癌患者的尿沉淀物样品中检测到。通过在来 自无癌症个体的对照尿沉淀物(CU)和来自膀脫癌患者的尿沉淀物(TU)中进行焦憐酸测序， 分析了 H0XA9、S0Xl、NPY、IRAK3、Z02和Ll-MET的DNA甲基化状态。进行了配对T检验。**:p< 0.01001。
[003引图6显示了 TURBT患者的尿沉淀物样品中每种标志物的DNA甲基化水平的示例性 Spearman相关性。
【具体实施方式】
[0039] 本发明的一个实施方式设及一种对受试对象的膀脫癌进行预测、预后和/或诊断 的方法，所述方法包括：
[0040] 提供来自所述受试对象的测试样品；
[0041 ] 测量所述测试样品中册乂49、50乂1、^￥、1341(3、1^-]\^1'和202中的一种或多种的0魁 甲基化水平；
[0042] 将所述测试样品中的所述一种或多种生物标志物的DNA甲基化水平与源自对照组 的所述一种或多种生物标志物的参比DNA甲基化谱进行比较，所述对照组的成员具有膀脫 癌;和
[0043] 基于所述比较，确定W下（1)、（2)和(3)中的至少一项：（1)膀脫癌是否已复发；（2) 是否存在膀脫癌复发的可能性;和(3)患者是否具有膀脫癌。
[0044] 本文所用的"膀脫癌复发"是指经活检证实的在对可见的原发性肿瘤的切除术后 出现的膀脫癌。如果得不到活检结果，"膀脫癌复发"也可W包括通过细胞学和膀脫镜检检 测到的伴随乳头状损伤出现的严重异型。对于测试受试对象或对照组，在适当时可W根据 美国癌症联合委员会的标准(世界卫生组织/国际泌尿病理学会（ISUP);参考文献26)来表 征肿瘤，并且基于肿瘤-节点-转移分类法（国际抗癌联盟)来进行分期。
[0045] 可W获益于本发明的方法、试剂盒和系统的受试对象包括具有或有风险发展出膀 脫癌或膀脫癌复发的受试对象。通常，由医师基于标准临床实践和测试来诊断膀脫癌，包括 醒IBC或MIBC。可W获益于本发明的方法、试剂盒和系统的受试对象通常是哺乳动物。在优 选实施方式中，受试对象是已被诊断为具有非肌肉浸润性膀脫癌(醒IBC)的人类患者，更优 选为在采集测试样品前已经历了至少一种膀脫癌治疗程序的患者。在特别优选的实施方式 中，患者之前已经历了TURBT，并且在该TURBT程序后处于肿瘤复发监视之下。作为另一选 择，患者可W具有肌肉浸润性膀脫癌(MIBC)。
[0046] 本发明的方法通常包括提供来自受试对象的测试样品。在本发明中使用的获自受 试对象的测试样品的生物来源不受特别限制，只要测试样品中的所关注的多核巧酸（即，选 自册乂49、50乂1、肥￥、11?41(3、1^-]\^1'和202)的0魁甲基化状态(或水平)反映出膀脫癌的相应 DNA甲基化状态(或水平）即可。运可W根据本文所述的实施例中讨论的方法和程序来验证。 优选的是，获自受试对象的测试样品使用非侵入性或最小侵入性程序来获得。
[0047] 在优选实施方式中，测试样品是尿样。尿样本可W包括来自"尿液"和"膀脫洗液" 的样品。如果选择膀脫洗液，则可W在护±或泌尿科医生进行膀脫镜检时收集膀脫洗液。尿 样的常见体积可W是约50ml。在另一个实施方式中，测试样品是包含膀脫癌CTC(循环肿瘤 细胞）的血样。可W对尿样或血样执行多种程序W使样品具有适于DNA提取和DNA甲基化分 析的形式。例如，可W将尿样在例如1500g离屯、10分钟W便随后从尿沉淀物中提取DNA(参见 Friedrich,Weisenberger等，2004)。
[004引本发明的方法通常包括测量测试样品中的册乂49、50乂1、肥￥、1341(3、1^-161'和202 中的一种或多种的DNA甲基化水平。本文所用的"DNA甲基化"是指在CpG二核巧酸的胞喀晚 残基的5位引入甲基。在正常细胞中，位于特定启动子区域的富含CpG的区域或CpG岛通常是 未甲基化的，因此允许转录活性，而在一些重复元件中出现的甲基化导致其沉默（Jones 1999;Jones 2002;De Carva化o，aiarma等，2012)。异常的DNA甲基化是在肿瘤发生过程中 出现的最早和最常见的表观遗传学变化之一，并且能够在癌前损伤中检测到(Wolff ,Byun 等，2010 CMhara等，2010;化nes 2012) dDNA甲基化的获得（高甲基化)或DNA甲基化 的整体丧失（低甲基化）（运会激活正常情况下不表达的基因）而导致的肿瘤抑制基因失活 已在膀脫肿瘤中观察到（JOrgens, Schmitz-D巧狭r等，1996;Kim和Kim 2009) eDNA甲基化变 化也可W是稳定的且可定量(Laird 2003;Wolff,Liang等，2005)。
[0049] 可用于本发明的生物标志物是W下多核巧酸中的一种或多种的至少一部分的DNA 甲基化水平:H0XA9、SOXl、NPY、IRAK3、Ll-MET和Z02。此处/'IRAK沪指IRAK3基因，即白介素-1受体相关激酶3蛋白编码基因。"H0XA9"指H0XA9基因，即同源框A9蛋白编码基因。"NPY"指 NPY基因，即神经肤Y蛋白编码基因。"SOXr指SOXl基因，即SRY(性别决定区Y)框1蛋白编码 基因/'L1-MET"指位于MET癌基因内的Line 1启动子/'Z02"还称作叮肝2"，是指UP2基因， 即紧密连接蛋白2的蛋白编码基因。用于在选定的多核巧酸中进行DNA甲基化测量、分析和 表征的所关注的区域优选包括至少富含CpG的区域或CpG岛，更优选位于选定基因的一个或 多个特定启动子区域中的富含CpG的区域或CpG岛。位于MET癌基因内的LI肥1元件化1-MET)激活MET的交替转录本并且是低甲基化的。在膀脫肿瘤中W及邻近的组织学上正常的 尿道上皮中，Z02的启动子是高甲基化的，表明表观遗传学变化发生在形态学变化之前，即 被称为表观遗传学视场缺陷的现象。相对于肿瘤上的膀脫细胞，在膀脫肿瘤癌细胞中 册XA9、SOXl、NPY、IRAK3也是高甲基化的。
[0050] DNA甲基化水平通常可W表示为甲基化胞喀晚的百分比，其为甲基化的胞喀晚数 量除W甲基化胞喀晚的数量与未甲基化胞喀晚数量的总和。DNA甲基化水平可W使用普通 技术人员通常知晓且可得到的方法来从测试样品中获得。运些方法通常可包括W下步骤： 从测试样品中提取DNA，亚硫酸氨盐转化，和对所关注的区域的PCR扩增。举例而言，可W使 用例如EZ DNA甲基化试剂盒(Zymo Research)根据制造商的操作说明来对测试样品中的 DNA进行亚硫酸氨盐转化。选定基因的所关注的区域可W使用表4中的生物素标记的引物来 进行PCR扩增，并通过焦憐酸测序来分析，焦憐酸测序是用于DNA序列检测的高通量定量工 具。在优选实施方式中，可W使用PSQ HS09(Qiagen)来测量DNA甲基化水平，所述DNA甲基化 水平可定义为甲基化胞喀晚的百分比，其为甲基化的胞喀晚数量除W甲基化与未甲基化胞 喀晚的总和。本领域普通技术人员将认识到运些。本领域普通技术人员将认识到测序和DNA 甲基化方法的替代性方法也同样适合。
[0化1] 当从册XA9、S0X 1、肥￥、1341(3、1^-]\^1'和202中选择一个且仅选择一个生物标志物 时，将所选标志物的DNA甲基化水平与参比DNA甲基化谱进行比较的步骤通常包括:将所选 标志物的DNA甲基化水平与阔值比较，所述阔值从具有膀脫癌的对照组的DNA甲基化谱产 生，并基于测试样品的DNA甲基化水平与所述阔值的比较，确定W下（1)、（2)和(3)中的至少 一项：（1)膀脫癌是否已复发；（2)是否存在膀脫癌复发的可能性;和(3)患者是否具有膀脫 癌。
[0化2] 虽然选自由H0XA9、S0X 1、肥￥、1341(3、1^-]\16巧日202组成的组的单个多核巧酸的 DNA甲基化水平可W用于实施本发明，但优选的是使用册XA9、S0Xl、NPY、IRAK3、Ll-MedP Z02中的至少两种或多于两种的DNA甲基化水平来产生"DNA甲基化谱"。当使用两种或多于 两种时，运可称为生物标志物的"组(panel)"。此外，"谱(profile)"通常包括代表与膀脫癌 有关的独特特征或特性的任何数据集/'DNA甲基化谱"包括代表选自由H0XA9、SOX 1、NPY、 IRAK3、L1-Met和Z02组成的组的两种W上多核巧酸的DNA甲基化水平(例如，甲基化状态）的 甲基化数据集。优选的是，DNA甲基化谱至少包括关于至少一种低甲基化的多核巧酸（旨化1-Me t)和至少一种高甲基化的多核巧酸（即册XA9、SOX 1、NPY、IRAK3、L1 -Me t和Z02)的DNA甲 基化数据。在特别优选的实施方式中，DNA甲基化谱包括针对至少SOXl、IRAK3和Ll-MET的 DNA甲基化数据。所选的生物标志物组的数量和类型不受特别限制，只要具有本文所述的足 够的准确度和特异性即可。优选的是，所选的数据组的准确度和特异性至少与本文所述的 50乂1、1341(3和1^-]\^1'组相同。
[0化3]当选择两种W上生物标志物的组时，将所选的标志物组的DNA甲基化水平与参比 DNA甲基化谱相比的步骤通常包括计算风险评分，其中，基于该风险评分，将患者分类为具 有复发性膀脫癌或具有发展复发性膀脫癌的可能性。该风险评分可W使用本文公开的逻辑 回归分析来获得。在一个实施方式中，风险评分代表了阳性结果（复发)在优势对数（log-odds) 标度上的概率。可 W 将该风险评分与从具有膀脫癌的对照组的 DNA 甲基化谱产生的阔 值进行比较，并基于风险评分与阔值的比较确定W下（1)、（2)和(3)中的至少一项：（1)膀脫 癌是否已复发；（2)是否存在膀脫癌复发的可能性;和(3)患者是否具有膀脫癌。在一个实施 方式中，所述阔值是OdW此标度，0分表示患者具有复发的概率为0.5(50%几率）。优选的 是，W此标度，预测复发的风险评分阔值为0,评分大于0时来自复发患者的几率大于50%， 评分小于加寸来自复发患者的几率小于50%。在优选实施方式中，风险评分是基于每个所选 的组成员的DNA甲基化水平的多变量等式。例如，当组为SOXl、IRAK3和Ll-MET时，实施例的 对照组的风险评分被确定为：
[0054] R = -0.37608+0.17095 XMsoxi+0.21604 XMIRAK3-0.09887 XMli-MET
[00对其中，R是风险评分，并且Msoxi、Mirak3和Mli-MET分别是SOXUIRAO和Ll-MET的甲基化 水平(表达为甲基化胞喀晚的百分比）。
[0056] 正风险评分可用于确定膀脫癌复发，例如，如本文所述，在一个实例中，在复发诊 断时在90% (34/38)的样品中发现了正风险评分，超过了细胞学的灵敏度（16%)和膀脫镜 检的灵敏度(8%)。此外，在尿样显示出正风险评分史的患者中，有80%(16/20)都在后来出 现了复发(95 % CI，62 %~98 % )。在70位不具有DNA甲基化正分史的患者中，有52位(74% ) 未复发(95%CI ,64%~85%;图4B)。此外，风险评分还有助于指导治疗医师的治疗决定，例 如使具有负风险评分的患者的膀脫镜检频率最小化。具有正风险评分但没有膀脫癌疾病临 床证据的患者仍然应当受到严密监视，因为他们具有高复发风险。
[0057] 本发明的一方面是建立适当的标志物组合，所述标志物组合能够在测试样品中检 测肿瘤复发或复发可能性，其特征在于高灵敏度和高特异性，其中，生物标志物选自册XA9、 SOX 1、NP