性高甲基化标志物SOXl和IRAK3与视场缺陷 低甲基化标志物Ll-MET的组合能够W高灵敏度和特异性检测疾病复发。运些结果还表明， 高DNA甲基化和低DNA甲基化之间的平衡对于膀脫癌发生是重要的，运进一步确立了该表观 遗传学视场缺陷是参与恶性肿瘤诱因的因子。
[007。实施例4:选定的DNA甲基化标志物可靠地预测了复发且假阳性预测率低(7%)。为 了评估在本发明的纵向研究样品中所述=标志物模型的甲基化是否预测复发，发明人在每 个于随访时获自90位TURBT患者的尿样中筛查了 DNA甲基化并计算了风险评分(-0.37608+ 0.17095 X S0X1+0.21604 X IRAK3-0.09887 X L1-MET)。在TURBT后无复发的组（图2C中报告 的CU样品）中由SOXl、IRAK3和Ll-MET的组合给出的DNA甲基化风险评分在数月的持续监视 期间都低于阔值（图3A;患者8617和7789)。相比之下，在肿瘤复发患者组中，DNA甲基化评分 发生了变化且高于阔值（图3B)。在复发诊断时，还在90%的样品（34/38)中发现了DNA甲基 化正分。当考虑相同的临床访视时，运些标志物的灵敏度优于细胞学（16%)和膀脫镜检 (8%)(图3C)。此外，在复发前(在一些情况下在临床诊断出复发前至少5个月）收集的尿沉 淀物中，DNA甲基化评分高于阔值（图3B，患者8928和6804)。为了对运S种标志物的预测值 进行量化，发明人在复发前分析了来自无复发患者的189个样品和来自最终复发的患者的 65个样品中的风险评分。通过分析所有样品（任何时候的访视），发明人发现在复发组中有 62% (103个尿样中的64个)具有DNA甲基化正分，而在无复发组中仅4% (189个尿样中的7 个)具有正分（图2A、2C、3C)。运代表了在复发前数月或数年检测到的样品数量分别比尿细 胞学(6%)和膀脫镜检(3%)增加10倍和20倍(图3C)。此外，发明人的结果显示，在随访期任 何时刻检测到的具有DNA甲基化正分的71个样品中，64个获自最终复发的患者(90%真阳性 预测率，TPR);而在具有负分的221个样品中，有182个与无复发是相关的（82%真阴性预测 率，TNR)(图3D)。运些结果证明，所述S标志物模型能够预测后来的复发，且与细胞学(7%) 或膀脫镜检(4%)相比具有明显高的概率。另一方面，在样品最初显示出DNA甲基化正分的 患者中，有47% (34个病例中的16个)后来出现了复发。在运16位患者中，有5位的样品始终 显示出正分，2位的样品显示出后续的波动结果;而其余9位的样品在复发前仅有一个收集 点。此外，在56个无复发的对照例中，有4个具有正分测试史(7%)。运些数据突出了在准确 解读=标志物模型的结果时评分史的重要性。综上所述，运些结果表明，与细胞学不同，在 早期随访时收集的尿沉淀物中检测的DNA甲基化标志物能够可靠地预测复发，且假阳性预 测率低(7%)。
[007引实施例5:示例性方法
[0074] A.患者和样品收集。该研究群体包括正在接受浅表NMIBC TURBT肿瘤复发监视的 患者。在每个可能的临床随访时，从90个此类NMIBC患者获得尿样。患者的年龄为41到96岁， 中位数年龄为69岁。在1991至2010年，随访时的尿液收集在南加州大学化SC)的Keck医学院 的泌尿科学系进行，其参照USC Norris综合癌症中屯、的制度指导来进行。如果因临床疑似 复发而认为必要的话，在USC的Keck医学院的泌尿科学系用化疗剂(丝裂霉素）或免疫治疗 剂（Bacile Calmette-Guerin;BCG)W常规间隔施用肿瘤切除后的佐剂膀脫内疗法。在5至 89个月期间(视患者而定），在不同的随访时在患者知情同意的情况下收集了共368个样品。 尿样收集的时间线示于图IA中。所有样品的临床病理学特征汇总于表1中。肿瘤复发由W下 手段来确定:活检或组织学证实的膀脫肿瘤，细胞学或膀脫镜检中严重的异型或乳头状损 伤，或在之前的手术后任何并发的疑似标准。在收集期间，34位患者具有肿瘤复发，而56位 患者到随后一次随访时未被诊断出复发。将34个复发样品的临床特征汇总于表2中。在34位 复发患者中，有31位提供了诊断时的尿样。对人类受试对象进行研究的许可获自USC Norris综合癌症中屯、评审委员会。根据美国癌症联合委员会的标准化dge, Byrd等，2010)来 诊断肿瘤，并且基于国际抗癌联盟的?M分类法来进行分期和分级（Sobin ,Gospodarowicz 等，2009)。
[0075] B.从尿沉淀物中提取DM并用焦憐酸测序进行DNA甲基化分析。将尿样(约50ml)在 1500g分离10分钟，并按照之前的报导从尿沉淀物中提取DNA^rie化ich,Weisenbe;rge;r等， 2004)。使用EZ DNA甲基化试剂盒(Zymo Research, Irvine,CA,美国）根据制造商的使用说 明对DNA进行亚硫酸氨盐转化。从发明人之前的研究(Wolff,化ihara等，2010)中选出6种 DNA甲基化标志物;使用带生物素标记的引物(表4)对所关注的区域进行PCR扩增，并用焦憐 酸测序进行分析，焦憐酸测序是用于DNA序列检测的高通量定量工具。如之前所描述 (胖〇^'，871111等，2010)，使用口59服96(91曰邑611，￥曰1611^曰，〔4，美国）来测量甲基化胞喀晚除 W甲基化和未甲基化胞喀晚总数得到的百分比。
[0076] C.统计学分析。ROC曲线汇总了本发明人的标志物在来自87个独立样品的DNA尿沉 淀物中的准确性，运些样品在最后一次随访时选自未复发患者(n = 56)，或选自复发患者第 一次复发时(n = 31)。将具有所有标志物的完整数据的83位患者的子集用来构建多变量预 测模型。发明人使用了逐步式逻辑回归，基于赤池信息量准则来选择要加入或减去的变量。 灵敏度和特异性使用5倍交叉验证对每个数据子分区重复进行模型选择来估算。随后用发 明人的数据集中的其余样品来评估最终模型。对照样品包括了最后一次随访前的访视，其 时患者未被诊断出患有膀脫癌;病例样品包括了出现在第一次复发后的复发样品和患者具 有膀脫癌的最初临床访视时的样品。
[0077] 虽然就具体的示例性实施方式和实施例描述了本发明，应理解的是，本文公开的 实施方式仅出于说明性目的，本领域技术人员可W在不背离由所附权利要求阐明的本发明 的主旨和范围的情况下做出各种修改和变化。
[0078] 参考文献
[0079] W下参考文献W其整体引用并并入本文中。
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