明所述的组合物通过PRMT5的抑制剂结合化p90的抑制剂协同抑制骨肉瘤 细胞的生长，同时在分子水平掲示运两种抑制剂协同作用的机理。
[0035] 2、本发明所述的组合物可W W溶液的形式使用，也可W将溶剂挥发后制作成为粉 末、W及纳米缓释组合物添加剂添加到相应的载体上。
[0036] 3、本发明将17-AAG的工作浓度从现有技术的UM等级减少数量级至nM等级，有效地 减少药物的副作用，并通过协同EPZ015666达到更高的骨肉瘤细胞抑制水平。
[0037] 4、本发明通过细胞实验证实PRms和化p90在分子水平上协同发挥作用，通过泛素 化降解PRMT5来实现祀向PRms抑制骨肉瘤Saos-2细胞的生长，所W本发明使用EPZ015666 通过协同作用进一步增强17-AAG的临床疗效，为骨肉瘤的防治提供新思路。
[003引说明书附图：
[0039] 图1为实施例1中PRMS在肉瘤中的表达情况图（1OOX)。
[0040] 图2为实施例2中试剂对骨肉瘤Saos-2细胞的毒性情况曲线图。
[0041 ]图3为实施例3中试剂对骨肉瘤Saos-2细胞的毒性情况曲线图。
[0042] 图4为实施例4中敲低PRirrs联合抑制化p90的活性对骨肉瘤细胞生长的影响情况。
[0043] 图5、6为实施例5中CO-IP检测电泳图。
[0044] 图7为实施例6中基于CHIP的突变体设计。
[0045] 图8为实施例6中CO-IP检测电泳图。
[0046] 图9为实施例6中PRMS的突变体设计。
[0047] 图10为实施例6中BiFC技术鉴定情况图示。
[004引图11-14为实施例7中WB检测结果图。
[0049] 图15为实施例8-10中本发明抑制骨肉瘤生长的OD图。
【具体实施方式】
[0050] 下面，结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0051 ] 具体实施例：
[0052] 实施例1 -4为说明PRMS和化p90在骨肉瘤细胞中的活性。
[0化3]实施例1
[0054]本实施例说明PRMS在骨肉瘤中高表达的情况：
[0化日]组织免疫组化步骤如下：
[0056] 1)将组织切片放入烘箱中，在溫度为63°C，时间为化的条件下进行烘烤；
[0057] 2)然后放入全自动染色机中进行脱蜡，脱蜡过程包括:二甲苯两缸，每缸15min;无 水乙醇两缸，每缸7min;90%酒精1缸，5min;80%酒精1缸，5min;70%酒精1缸，5min;
[0058] 3)从染色机中取出片子，用纯水冲洗3次，每次Imin;冲洗完毕后采用巧樣酸高压 修复法修复5min;之后使抗原修复后的片子自然冷却30min;
[0059] 4)将片子放入内源性过氧化物酶阻断剂中，15min后取出片子，用PBS缓冲液冲洗3 次，每次Imin;
[0060] 5)取一抗PRMT5,按照稀释度1:400用DAKO的抗体稀释液稀释后加入；室溫解育 SOmin;加入二抗并解育30min;用PBS冲洗3次，每次Imin;
[0061 ] 6)DAB试剂盒显色5min，苏木素复染40s，在0.25 %的盐酸酒精（400mL70 %酒精+ ImL浓盐酸）中浸没2s，用自来水冲洗2min;
[0062 ] 7)将片子放入全自动染色机进行脱水，取出封片。
[0063] 结果如图1所示，PRMT5在正常软骨(Normal cadilage)中几乎不见表达，在肉瘤 组织如尤文肉瘤巧wing cartilage)、软骨肉瘤(化omlrosarcoma)中呈低表达，在骨肉瘤如 成纤维肉瘤骨肉瘤（Fibrosarcoma osteosarcoma)、成软骨骨肉瘤（Chondroblastic osteosarcoma)中呈高表达。恶性黑色素瘤(Malignant melanoma)为阳性对照，用于优化 PRMT5抗体的稀释度。
[0064] 实施例2
[0065] 本实施例说明抑制PRMT5的活性、抑制化p90的活性、W及联合抑制PRMT5和化p90 的活性对骨肉瘤细胞活性的影响：
[0066] 步骤如下：
[0067] 1)实验分为对照组(不使用任何试剂处理）、使用20nM的EPZ015666单独处理组、使 用I OnM的17-AAG单独处理组和20nM的EPZO15666联合I OnM的17-AAG处理组；
[0068] 2)四组实验中，均处理骨肉瘤Saos-2细胞4她，然后分别利用CCK-8法检测试剂对 骨肉瘤Saos-2细胞的毒性情况。
[0069] 结果如图2所示:EPZ015666单独处理能有效地降低骨肉瘤Saos-2细胞的活性，17-AAG单独处理也可W有效地降低骨肉瘤Saos-2细胞的活性，当两种试剂联合处理时，细胞活 性出现更加明显的降低，说明两种试剂联合使用可W协同使骨肉瘤细胞活性大幅度降低。
[0070] 实施例3
[0071 ]本实施例加大试剂的工作浓度W研究对骨肉瘤细胞活性的影响：
[0072] 本实施例分为对照组(不使用任何试剂处理）、使用50nM的EPZ015666单独处理组、 使用25nM的17-AAG单独处理组和50nM的EPZ015666联合25nM的17-AAG处理组；其余步骤与 参数与实施例2相同。
[0073] 结果如图3所示:对骨肉瘤Saos-2细胞的活性影响趋势同实施例2。
[0074] 实施例4
[0075] 本实施例说明敲低PRms的表达、敲低PRMT5联合抑制化p90的活性对骨肉瘤细胞 活性的影响：
[0076] 1)实验分为对照组、IOOnM的17-AAG单独处理组(24h)、siRNA转染Saos-2细胞敲低 Piarrs的表达组(4化）、敲低Piarrs联合IOOnM的17-AAG处理组(2地）；
[0077] 2)四组实验中，分别利用CCK-骑去检测试剂对骨肉瘤Saos-2细胞的毒性情况。
[0078] 实验结果来自S次独立的重复实验。结果如图4所示:敲低PRMT5能有效抑制骨肉 瘤Saos-2细胞的生长，17-AAG单独处理也能有效抑制骨肉瘤Saos-2细胞的生长，敲低PRirrs 联合17-AAG处理，细胞活性出现更加明显的降低，说明两种试剂联合使用可W协同使骨肉 瘤细胞活性大幅度降低。
[0079] 实施例5-7为公开祀向PRMS联合17-AAG协同抑制细胞生长的分子机制。
[0080] 实施例5
[0081 ]本实施例说明PMT与化p90复合物中CHIP中的泛素化连接酶E3相互作用：
[0082] 1)利用CO-IP技术证明细胞外源转染的PRMT与CHIP蛋白存在相互作用。步骤如下：
[0083] a)选择转染效率较高的皿K293T细胞进行实验，将Myc-PRMTS质粒分别与化AG-Vector及FLAG-CHIP质粒共转染到肥K293T细胞4她，同时使用MG132蛋白酶抑制剂处理细胞 化阻止发生泛素化的蛋白质降解。
[0084] b)全细胞裂解液使用FLAG的抗体进行IP，然后使用FLAG和Myc的抗体进行WB检测。
[0085] 结果如图5所示:外源表达的FLAG-CHIP与Myc-PRMS相互作用，结合在一起。
[0086] 2化觀巧与CHIP的相互作用W及17-AAG对二者相互作用的影响，步骤如下：
[0087] a)GST pulldown技术检测GST-CHIP与Myc-Piarrs的相互作用：GST和GST-CHIP融合 蛋白在Ecoli.中进行体外表达，然后与转染了Myc-Piarrs的肥K293T细胞裂解液一起进行解 育，将GST和GST-CHIP结合的复合物进行WB检测，检测结果如图6A所示。
[008引 b)利用CO-IP技术检测17-AAG对内源性PRMT5与CHIP的相互作用的影响:肥K293T 细胞进行IOOnM的17-AAG处理2地，W及MG132处理化，然后进行CO-IP检测，检测结果如图她 所示。
[0089] 如图6A所示，利用GST-pulldown技术可W证明体外表达的GST-CHIP可W下拉到 PRMT5。如图6B所示，当使用17-AAG预处理抑制化p90的活性W后，CHIP与PRms的结合明显 增加。CHIP与Piarrs的结合增加将促进泛素化连接酶E3对Piarrs的泛素化降解。
[0090] 实施例6
[0091] 本实施例说明CHIP与PRirrs相互作用的结构域确定。
[0092] 1)为了鉴定哪些结构域对PRMT5/CHIP的相互作用起关键作用，我们构建了基于 CHIP的一系列突变体:点突变体K30A和肥60Q、删减突变体TRP和U-box，如图7所示。
[0093] 肥K293T细胞共转染FLAG标签的CHIP片段或突变体W及Myc-Piarrs质粒4她，MG132 处理化，全细胞裂解液进行CO-IP实验，结果如图8所示。
[0094] 与全长FLAG-CHIP和Myc-PRMTS的相互作用相似，H260Q及TPR突变体Co-IP到更多 的Myc-PRM巧，提示与PRMT5的相互作用略微增加。然而，另外两个突变体K30A及U-box几乎 完全阻断了与PRMT5的相互作用，提示TPR结构域对于CHIP与PRMT5的相互作用很关键，且 CHIP与Piarrs的相互作用依赖分子伴侣的存在。
[0095] 2)为了鉴定PRMT5中能与CHIP相互作用的结构域，基于PRMT5的晶体结构，W全长 Myc-PRMTS为模板，我们构建了PRms的另外