两个删减突变体N-端突变体1-292及C-端突变 体229-637如图9所示。
[0096] 因为PRMT5具有发生聚集体的倾向，因而，我们采用BiFC技术来鉴定PRMT5中能与 CHIP相互作用的结构域，该方法具有W下优点：一方面BiFC能更直观地观察PRms及其突变 体与CHIP在活细胞内的实时相互作用；另一方面BiFC技术使得我们能更好地可视化研究 CHIP对Piarrs及不同突变体的聚集体的影响。
[0097] COS-I细胞共转染如图9所示的PRMT5或其突变体质粒24h，Signal/Noise(S/N) Ratio越高表示二者的相互作用越强，结果如图10所示。
[009引 PRMT5的N-端结构域是PRMT5与CHIP相互作用的关键结构域，因为与全长PRMT5相 比，N-端1-292结构域观察到更多的巧光。相反，在C-端突变体229-637组观察到非常低的 Si即al/noise比率，刚好能作为我们BiFC技术的阴性对照。W上结果证明CHIP的WR结构域 与Piarrs的N-端对于CHip/piarrs的相互作用是必需的。
[0099] 实施例7
[0100] 本实施例说明CHIP/chaperone系统介导PRMS的降解。
[0101] 1) InM~IOOnM的17-AAG对肥K293T细胞进行处理2地，然后裂解，进行WB，结果如图 11所示。
[0102] 依据W上实施例，我们推测17-AAG可W通过CHIP连接酶E3的活性下调PRMT5的表 达，促进PRMT5的泛素化降解。我们发现17-AAG剂量依赖地降低皿K239T细胞中PRMT5的表 达。
[0103] 2)
[0104] a)肥K293T 细胞转染化 AG-Vec tor 或 FLAG-CHIP (CHIP)表达 48h，并进行 17-AAG 处理 2地，裂解细胞进行WB，结果如图12A所示：17-AAG处理可W进一步促进CHIP介导的PRMT5表 达下调。
[0105] b)肥K293T细胞转染SiRNA Control(SiCon)或SiRNAs CHIP(SiCHIP),表达60h，并 进行17-AAG处理2地，裂解细胞进行WB，结果图12B所示，进一步的结果表明，敲低CHIP可W 抑制17-AAG诱导的Piarrs下调，证明在细胞水平上PRMS的表达可W被CHIP/chaperone系统 调控，17-AAG诱导的Piarrs表达水平的下调与CHIP的协同作用有关。
[0106] 3)接下来，我们推测CHIP可能介导了 PRM^的多聚泛素化修饰进而降解PRM^D
[0107] 为了证明CHIP 可 W 泛素化 PRMT5,首先将 Myc-PRM^ 与 FLAG-CHIP 及 HA-Ubiquitin 一起转染到肥K239T细胞而进行体内的泛素化检测，结果如图13所示：显示过表达CHIP可W 增加PRMT5的泛素化。当共转染Myc-PRM^与K30A及H260Q突变体时，K30A及H260Q突变体明 显地降低PRirrs的泛素化，提示CHIP与分子伴侣的结合活性及完整的u-box结构域对于CHIP 诱导的PRMT5多聚泛素化很重要。另外，H260Q也可作为显性负性突变体来竞争内源性的 CHIP,因为在肥60Q过表达组中，Piarrs的泛素化又进一步降低。
[0108] 4) 17-AAG对敲低CHIP及其突变体诱导的PRirrs泛素化的影响。
[0109] 肥 K293T 细胞共转染 31(：〇11、31邸1?、]\17。斗1?0'5、齡-加1911^111或311?酷的质粒，表 达60h，并且17-AAG处理12h，然后细胞裂解液进行IP和相应的WB检测，检测结果如图14所 示:相反，敲低CHIP可W降低17-AAG诱导的PRMT5的多聚泛素化，提示CHIP参与了 17-AAG诱 导的Piarrs泛素化调节。
[0110] 实施例8-10为说明通过祀向PRirrs抑制骨肉瘤生长的组合物的制备方法。
[01川实施例8
[0112] -种通过祀向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物的制备方法，其特征在于包括W下 步骤：
[0113] 1)将5m巧PZO15666溶解到 1.3040mL的DMSO中，形成 1 OmM的EPZO15666储备液；
[0114] 2)将 10mgl7-AAG溶解至Ijl .7074mL的DMSO中，形成IOmM的 17-AAG储备液；
[0115] 3)将0.2mL的EPZ015666储备液和O.lmL的17-AAG储备液混合后，用DMSO稀释至 EPZ015666的工作浓度为20nM，17-AAG的工作浓度为IOnM,形成通过祀向PRms抑制骨肉瘤 生长的组合物。
[0116] 4)将得到的组合物处理骨肉瘤Saos-2细胞4她，CCK-8方法检测细胞活性。
[0117] 实施例9
[011引本实施例的特点在于步骤3)中，将0.2mL的EPZ015666储备液和0.2mL的17-AAG储 备液混合后，用DMSO稀释至EPZ015666的工作浓度为20nM，17-AAG的工作浓度为20nM，形成 通过祀向Piarrs抑制骨肉瘤生长的组合物。其余步骤和参数与实施例8相同。
[0119] 实施例10
[0120] 本实施例的特点在于步骤3)中，将0.2mL的EPZ015666储备液和0.4mL的17-AAG储 备液混合后，用DMSO稀释至EPZ015666的工作浓度为20nM，17-AAG的工作浓度为40nM，形成 通过祀向Piarrs抑制骨肉瘤生长的组合物。其余步骤和参数与实施例8相同。
[0121] 实施例8-10的结果如图15所示，S个联合组均能有效抑制骨肉瘤细胞生长，从OD 值看出，EPZ015666联合17-AAG可W达到骨肉瘤细胞生长抑制率50%^上。而单独0.4咖的 17-AAG处理使Saos-2细胞的活力下降16.5%，所W本发明使用EPZ015666联合17-AAG其效 果是单独〇.4測的17-AAG处理2倍W上，考虑到17-AAG带来的副作用，采用17-AAG的工作浓 度为IOnM时组合物的工作浓度最低且效果最好。
[0122] 对于本领域的技术人员来说，可根据W上描述的技术方案W及构思，做出其它各 种相应的改变W及变形，而所有的运些改变W及变形都应该属于本发明权利要求的保护范 围之内。
【主权项】
1. 一种通过祀向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物，其特征在于包括PRMT5抑制剂和 Hsp90抑制剂； 所述PROTS抑制剂为EPZO15666;所述Hsp90抑制剂为17-AAG。2. 如权利要求1所述的通过祀向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物，其特征在于：所述 EPZO15666的结构式为：所述EPZO15666的分子量为383.44。3. 如权利要求1所述的通过祀向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物，其特征在于:所述17-AAG的结构式为：所述17-AAG的分子量为585.69。4. 如权利要求1所述的通过祀向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物，其特征在于:按摩尔 质量比计算，EPZ015666:17-AAG 为 0.5~2:1。5. 如权利要求4所述的通过祀向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物，其特征在于:按摩尔 质量比计算，EPZO15666:17-AAG为2:1。6. 如权利要求1所述的通过祀向PRms抑制骨肉瘤生长的组合物的制备方法，其特征在 于包括W下步骤： 1) 将EPZO15666溶解到溶剂中，得到EPZO15666储备液； 2) 将17-AAG溶解到溶剂中，得到17-AAG储备液； 3) 将步骤1)得到的EPZO15666储备液和步骤2)得到的17-AAG储备液混合，得到通过祀 向Piarrs抑制骨肉瘤生长的组合物。7. 如权利要求6所述的通过祀向PRms抑制骨肉瘤生长的组合物的制备方法，其特征在 于:所述溶剂为DMSO。8. 如权利要求6所述的通过祀向PRms抑制骨肉瘤生长的组合物的制备方法，其特征在 于:步骤1)中，所述lmLEPZ015666储备液中含EPZ015666的质量为1.7~4mg。9. 如权利要求6所述的通过祀向PRms抑制骨肉瘤生长的组合物的制备方法，其特征在 于:步骤2)中，所述ImLl7-AAG储备液中含17-AAG的质量为2.7~6mg。10. 如权利要求6所述的通过祀向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物的制备方法，其特征 在于:步骤3)中得到的通过祀向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物中，EPZ015666与17-AAG的 摩尔质量比为0.5~2:1。
【专利摘要】本发明公开了一种通过靶向PRMT5抑制骨肉瘤生长的组合物，包括PRMT5抑制剂和Hsp90抑制剂：所述PRMT5抑制剂为EPZ015666；所述Hsp90抑制剂为17-AAG；按浓度比计算，EPZ015666：17-AAG为0.5～2:1；所述组合物的制备方法，包括以下步骤：1)将EPZ015666溶解到溶剂中，形成EPZ015666储备液；2)将17-AAG溶解到溶剂中，形成17-AAG储备液；3)将EPZ015666储备液和17-AAG储备液混合，形成组合物；本发明所述的组合物通过PRMT5的抑制剂结合Hsp90的抑制剂协同抑制骨肉瘤细胞的生长。
【IPC分类】A61K31/395, A61P35/00, A61P19/00, A61K45/06, A61K31/506
【公开号】CN105497034
【申请号】CN201510903885
【发明人】张还添, 查振刚, 高学娟, 谭文成, 刘宁, 杨杰
【申请人】暨南大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月8日