于适当体积的TE缓冲液（pH8. 0) 中。
[0183] 实施例2
[0184] PCR克隆三欣卡辛合成基因：
[0185] 50 μ L PCR体系的组成：
[0186]
[0187] PCR 程序：
[0188] Taq 酶
[0189] 循环 I :94°C，3min，1 轮循环；
[0190] 循环 2 :94°C，30s ;55-65°C，30 ;72°C，lmin/kb ;35 轮循环；
[0191] 循环 3 :72°C，5-10min ;1 轮循环。
[0192] Primestar ：
[0193] 步骤 l:98°C，10s
[0194] 步骤 2 :58_65°C，15s
[0195] 步骤 3 :72°C，lmin_3min
[0196] 步骤1-3循环30轮
[0197] 步骤 4 :72°C，IOmin
[0198] 不同引物的PCR条件都是以上述条件为基础进行优化的。
[0199] PCR以后，将预期大小的DNA条带低熔点胶回收纯化，并连接到PCR克隆载体 pGEM-TEasy载体中，转化E.coli DH5a，涂布在含有氨节青霉素（ampicillin，Amp)，异丙 基硫代 _β _D_ 半乳糖苷（isopropyl β -D-thiogalactoside，IPTG)和 5-溴 _4_ 氯 _3_ 口引 哚-D-半乳糖苷（5-Br-4-Cl-3-indole_i3 -D-galactoside，X_gal)的 LB 平板上进行蓝 白斑筛选，挑取白色克隆进行鉴定。插入有预期大小DNA片段的质粒测序。
[0200] 有时，引物两端设计有酶切位点，可以克隆入合适的载体中，酶切鉴定或测序。
[0201] 实施例3核酸分子杂交
[0202] 1)地高辛DNA标记：将待标记的DNA用无菌水稀释至总体积15 μ L，沸水浴中加 热变性10分钟，立即置于冰盐浴中冷却。接着加入2 μ L引物混合物，2 μ L dNTP混合物， 1 μ L酶，混合均匀后，37°C水浴约16小时。加入0. 8 μ L0. 8M EDTA (pH8. 0)以终止反应，加 入2. 5 μ L4M LiCl混合均匀，再加入75 μ L预冷的无水乙醇沉淀标记后的DNA，置于-80°C 沉降40分钟。4°C，12000rpm离心20分钟收集DNA，用预冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀，真空 干燥后重新溶于50 μ L TE (ρΗ8· 0)中。
[0203] 2)菌落杂交（文库筛选）的膜转移：将保存于-80°C的基因文库稍融，取50 μ L，用 450 μ L LB稀释得到KT1的稀释倍数，倍比稀释得到10_2,10_3,10_ 4,10_5,10_6。300 μ L涂平板 (15cmX 15cm，平板为LB/50 μ g/mL卡那霉素）。选取合适的比例，使每块平板约1200-1500 个克隆。照选定的比例均匀涂布四块平板，37°C培养过夜。根据平板的大小剪取尼龙膜，小 心地覆盖于平板表面不要产生气泡，做好位置标记，1分钟后取下尼龙膜置于干燥滤纸上， 干燥10分钟直至菌落结合在尼龙膜上。原始的平板置于培养箱中4-5hr，使克隆重新生长 作为原平板。将尼龙膜置于变性液（〇. 25MNa0H，I. 5M NaCl)饱和的滤纸上15分钟（不要 浸过膜），转移至中和液（1.0M Tris.HCl，1.5M NaCl，pH7. 5)饱和的滤纸上5分钟。转移 至2XSSC(20xSSC储备液（Γ1) :NaCl，175. 3g，柠檬酸钠，88. 2g，pH=7. 0)饱和的滤纸上自 然风干。取下尼龙膜置于烘箱中，120°C固定45分钟。常温下于3XSSC/0. 1%SDS溶液中振 荡洗涤3小时，以除去细胞碎片。
[0204] 3)预杂交和杂交：预热杂交液（20mL/100cm2)至杂交温度68°C，放入杂交尼龙膜， 轻轻振荡并保温30分钟。将DIG标记的DNA探针在沸水浴中变性5分钟，立即置于冰盐浴 中冷却。冷却后，将DNA探针与合适体积的DIG杂交液（2. 5mL/100cm2)混合均匀。去除预 杂交液并立即把DNA探针/DIG杂交液加入，轻轻振荡保持杂交温度64°C或68°C约16小 时。
[0205] 4)杂交后洗脱：室温下用2XSSC/0. 1%SDS漂洗两次，每次5分钟。68°C，用 0.1 X SSC/0. 1%SDS振荡漂洗两次，每次15分钟。
[0206] 5)显色反应和检测：严紧洗脱后的尼龙膜在洗涤缓冲液（0.1 M马来酸， 0· 15MNaCl，pH=7. 5, 0· 3%(v/v)吐温20)中平衡1-5分钟，接着在封闭缓冲液（封闭试剂以 10%的浓度溶于〇. IM马来酸，0. 15M NaCl，pH=7. 5)中封闭30分钟，然后在抗体中浸泡30分 钟。用洗涤缓冲液漂洗尼龙膜两次后，用检测缓冲液（〇. IM Tris-HCl，0. lMNaCl，pH=9. 5)中 平衡2-5分钟，最后将尼龙膜置于IOmL新配制的显色溶液[NBT溶于70%DMF，浓度为70mg/ mL，BCIP溶于水，浓度为50mg/mL。用时IOmL显色溶液中加45yL NBT，35yL BCIP]中，置 于黑暗中显色。显色合适后用去离子水漂洗以终止反应。
[0207] 实施例4三欣卡辛生物合成基因簇的克隆
[0208] 提取Streptomyces bottropensis D0-45的总DNA,利用试剂盒进行基因组文库 构建，构建方法按照试剂盒的说明进行。所使用的试剂盒为CopyControl? Fosmid Library Production Kit,购自 EPICENTRE Biotechnologies 公司。
[0209] 如前文所述，根据KS α和KSe的保守氨基酸序列设计了简并引物（For (KS α ) :ATC ACC GTG GCC TGY TTY GAY GCS ATC-3'， Rev(KSP) :CC GGT GTT GAC SGS RTA GAA CCA NGC ;S=C 或 G, Y=C 或 T, R=A 或 G)进行 PCR，从 Micromonospora sp. TP-A1304 基因组 DNA 中 扩增得到了 I. Ikb的片段，克隆入pGEM-TEasy载体，测序验证其的确与II型PKS相关。用 地高辛标记上述I. Ikb片段作为探针，通过原位杂交从基因组文库中筛选阳性克隆，得到 黏粒CZM04-4 ;通过PCR分析该黏粒，发现该黏粒不仅包括KS基因，同时也包括UDP-葡萄 糖-4, 6-脱水酶的基因信息，再根据CZM04-4端基测序结果发现其一端已经包含基础代谢 的基因信息（编码膜蛋白和脂蛋白），另外一端则编码信息为未知蛋白，故对其进行全菌测 序。获得其完整信息后经体内中断实验证实其确实与三欣卡辛合成相关。根据该黏粒设计 探针进行染色体步移，得到黏粒CZM05-09-2。由于这两个黏粒还是未完全包含合成三欣卡 辛的信息，包括糖基转移酶及氧甲基转移酶的信息均不完全，故再在CZM05-09-2末端设计 探针进行菌落原位杂交实验，最终获得第三个黏粒CZM06-10-2,该三个黏粒进行拼接后共 包含有102, 575bp的基因信息。包含了完整的三欣卡辛生物合成基因簇（图2A)。3个相 互交叠的黏粒代表了三欣卡辛产生菌Streptomyces bottropensis DO-45基因组已测序的 102. 6kb DNA区域。如图2B所示，三欣卡辛生物合成基因簇的基因组成；II PKS=II型聚酮 合酶基因 ；PKS initiation :聚酮合酶起始单元相关基因 ；Tailoring :后修饰基因 ；Sugar : 糖基合成相关基因；Regulation/resistance :调节/抗性基因 ；Unknown :无明显作用的基 因 ；Beyond cluster:三欣卡辛基因簇外的基因。
[0210] 实施例5PCR_targeting技术（Red-ET基因打革巴）
[0211] I. PCR-targeting 片段制备
[0212] 以商业化的盒子为模板为模版（含Am抗性基因），PCR溶液组分同前，聚合酶采用 高保真酶primer star和Takara Taq DNA polymerase -起，进行PCR反应。PCR产物用琼 脂糖凝胶电泳分离分析，与预期大小符合的条带，Kit回收，溶于50 μ 1无
[0213] 酶双蒸水。
[0214] PCR 程序
[0215] 循环 I :94°C,2min，1 轮；
[0216] 循环 2 :94°C，45sec;5(TC，45sec;72°C，90sec ;10 轮；
[0217] 循环 3 :94°C，45sec;55t：，45sec;72°C，90sec ;15 轮；
[0218] 循环 4 :72°C，5min ;1 轮。
[0219] 2. 11. 2 电转化
[0220] 将黏粒转化入E. coli BW25114感受态细胞（含有pIJ790)，涂布于含有50yg/ mLAmp和30 μ g/mLCm的LB平板上30°C培养过夜。挑选取大肠杆菌单菌落接种入3ml含有 25 μ g/mLCm50 μ g/mLAmp的SOB中，30°C摇床培养过夜。接种500 μ L菌液至50mL新鲜的SOB 培养基（含25yg/mL Cm，50yg/mLAm)中，同时添加50(^1^]\^-阿拉伯糖，301：培养约2~ 3h至0D600~0. 6。3800rpm，4°C离心10min回收菌体，尽量弃掉上清，加入lmLIO%甘油，打 散沉淀，再加9mL10%甘油，摇匀。3800rpm，4?离心10min,弃掉上清，用10%甘油洗漆。重复 上面操作4次左右：3800rpm，4°C离心10min，尽量弃去上清，用100 μ L10%甘油重悬。与此 同时准备电击杯，洗净后泡于70%的乙醇中，从乙醇中取出保存好的电击杯，在超净台下用 无水乙醇洗涤两次，最大风力下吹干，置于冰上或冰箱预冷30min。将100 μ L感受态细胞与 1~2 μ LPCR产物混匀，加入预冷的0.1 cm的电击杯中，电击条件采用200 Ω，25uF，I. 8kv， 电击时间4. 5~4. 9ms，立即加入1ml预冷的LB，37°C培养60min后；涂布于含有50μ g/ml Am和50 μ g/ml Cm的LB平板，37 ° C过夜培养。挑取单克隆接种至50 μ g/mlAm和50 μ g/ mlCm的液体LB中，而后抽提质粒，溶于50μ1 TE溶液，再次转化E.coli S17-1中进行纯 化，而后挑取单克隆接种，菌液提取质粒进行酶切或者PCR鉴定。
[0221] 实施例6三欣卡辛产生菌Streptomyces bottropensis D0-45基因敲除方法
[0222] (一）带有Marker的基因置换突变株（以txn8为例）
[0223] (1)基因置换黏粒的构建
[0224] 设计引物 Tg-ks8-f: ACTTCTCACCGATGGCCGATCGGCCACACGCACCATCAGATTCCGGGGATC CGTCGACC 和 Tg-ks8-R:GTACTTCCCTCGCGGATCAGCTCCACCGCGTGTCCGATCTGTAGGCTGGAGCTGCTT C，以Targeting盒子为模板扩增得到I. 5kb左右的片段（两端包含有39bp的同源臂），按 照实施例5的方法获得包含有目标缺失基因置换成Am抗性的黏粒，并将其转化到大肠杆菌 S17-1中，经过PCR验证正确后，作为接合转移的供体菌。
[0225] (2)通过接合转移获得基因置换单交换突变株
[0226] 从经过转化的大肠杆菌（E. coli S17-1)培养平板上挑取单菌落接到试管中培养 过夜，吸取500 μ 1的菌液接到25ml LB中，置于37°C摇床中培养至OD6tltl为0. 4-0. 6。将菌 液离心沉淀，用35mL LB培养基洗涤两次，然后用Iml的LB培养基重悬，作为供体菌。
[0227] 取冻存于-80°C、20% 甘油保存的链霉菌 Streptomyces bottropensis D0-45 的 孢子悬液500 μ L，用等体积的TES缓冲液洗两次，重悬于等体积的TES缓冲液，50°C热激 IOmin使孢子萌发。再加等体积的TSB，37°C温育2-5hr。离心重悬于ImL LB中作为受体 菌。
[0228] 将不同浓度的受体细胞10 0 μ L与等体积的供体细胞混合直接涂布在含有 10mMMgC12的IWL-4或MS平板上，30°C培养12-18hr后，在每一平板的表面覆盖含萘啶酮酸 (nalidixic acid,终浓度为50 μ g/mL)和Am抗生素的ImL无菌水。30°C培养5天以上挑 取接合子。接合子如果能够在含有阿泊拉霉素50 μ g/ml的TSB培养基中生长，则为目标基 因被替换（至少已是单交换）的突变株。（图7)
[0229] (3)基因置换双交换突变株的获得
[0230] 已经摇浓的带有Am抗性的TSB菌液，取IOul加入到无抗的TSB中（松弛培养）， 30°C培养24hr后，取l-5ul菌液经过200ul无菌水的稀释后涂在