带有Am抗性的MS平板上， 2-3天后长出单克隆，经过对部分单克隆PCR验证，凡是只能扩增出单一的I. 5kb大小的而 不能扩增出野生型（一般五六百个碱基）条带的即为发生双交换置换的突变株。经过不断 的松弛培养和涂板PCR验证最终获得完全发生双交换的基因置换突变株。（图7)
[0231] (二）同框缺失突变株的获得
[0232] 该方法与上述中基因置换突变株的方法大部分是一样的，开始的同源臂PCR时， 必须以带有Am抗性的LoxP质粒为模板进行扩增，引物与方法（一）中的一样，均为59bp 包含有39bp同源臂序列的基因片段。同样的方法获得基因置换黏粒，最终接合转移获得带 有抗性基因的基因置换突变株后，还需要再发生一次接合转移，利用导入含有Cre基因的 质粒于链霉菌中，通过抗性基因 Tsr (硫链丝菌素）来筛选接合转移平板的接合子，最终在 无抗的TSB松弛下丢掉trs抗性，并通过PCR验证获得基因型正确的同框敲除突变株（该 突变株PCR扩增出的条带远小于野生型的大小通常为200-400bp)。其中的原理是因为Cre 基因编码的蛋白识别Loxp位点,利用Loxp自身的同源重组从而将其中间的Marker序列缺 失，从而获得同框缺失突变株。（图7)
[0233] 实施例 7 链霉菌 Streptomyces bottropensis D0-45 产量的提高：
[0234] 之前文献[The Jounal of Antibiotics. 1981，1520]报道三欣卡辛的产量 l-2mg/ L，利用文献报道的种子（每100ml:玉米汁0· 5g，蔗糖2g，果糖lg，葡萄糖lg。K2HPO4O. 15g， MgSO40.0 5g，CaC032g，KCKX 4g。ρΗ=7· 0)培养基和发酵培养基（每100ml:可溶性淀粉6g， 玉米汁lg，微量元素）发酵后（表2)(表3)，发现三欣卡辛的产量不太稳定，而且产量也不 商。
[0235] 为了获得一种稳定的发酵条件同时提高三欣卡辛的产量，改动原有发酵培养基的 配方为SYG培养基（每100ml:可溶性淀粉6g，葡萄糖lg，酵母提取物lg，微量元素 （CuSO 4 · 5H207mg，FeSO4 · 7H201mg，MnCl2 · 4Η200· 8mg，ZnSO4 · 7Η200· 2mg，CoCl2 · 7Η200· 0006mg))，种 子培养基则改为普通的TSB培养基；同时最关键的是尝试在发酵时加入了大孔树脂HP20， 并摸索了 HP20的加入时间和加入量。最终确定了在刚开始发酵时便加入质量比为50%的 HP205g每100mL (表3-2)，发酵五天时间即可收菌，经过进一步柱纯化最终分离得到三欣卡 辛A纯品约500mg/L，产量提高了近400倍。（图4，图5)
[0236] 表2发酵培养基中的微量兀素
[0237]
[0238] 表3-1:原有液体培养基
[0239]
[0240] 表3-2 :改进后液体培养基
[0241]
[0242] 图6显示了本实施例中，改变配方后加入大孔树脂HP20,三欣卡辛产生量的提高。 表格为HP20在发酵时加入的时间，" + "代表产量高低，越多则产量越高。由上到下依次为 未加 HP20,初始加入HP20,第三天加入HP20,发酵后加入HP20的发酵液HPLC图，明显可以 看出发酵初始时加入HP20产量最高。
[0243] 实施例8链霉菌Streptomyces bottropensis D0-45基因敲除突变株的发酵和产 物鉴定：
[0244] (1)突变株的发酵
[0245] 接种基因型正确的孢子20ul到50mL发酵培养基TSB (250mL摇瓶）中30°C，250rpm 培养至呈对数生长期（36hr)。接种2. 5mL至50mL发酵培养基SYG (可溶性淀粉6g，葡萄糖 lg，酵母提取物 lg，CuSO4 · 5H207mg，FeSO4 · 7H201mg, MnCl2 · 4Η200· 8mg，ZnSO4 · 7Η200· 2mg， CoCl2 · 7H200. 0006mg) (%)中，再加入灭过菌的大孔树脂HP20(质量比为50%)的2ml，在 30°C，220rpm条件下培养5天。离心收集沉淀，用丙酮分两次浸泡，并超声IOmin,离心去沉 淀后，旋转蒸发仪旋去上清中丙酮，水相用乙酸乙酯萃取三到五次，有机相用饱和食盐水洗 两次后旋去乙酸乙酯，用少量甲醇溶解。取20 μ L稀释到Iml甲醇中做HPLC。
[0246] 各突变株以及野生型均采用相同的方法进行发酵和发酵液的处理。如果要分离突 变株产生的化合物，则需要将发酵量扩大至1-4升，扩大的方法是增加发酵摇瓶的数量；菌 体培养方法和发酵液处理方法与前面相同。
[0247] (2)突变株发酵产物的鉴定
[0248] 高效液相色谱（HPLC)分析
[0249] 将突变株的发酵提取液与野生型菌株的发酵提取液分别用HPLC检测，通过对比 检测结果确定突变株是否产生新的化合物。具体做法是将发酵液提取物溶于甲醇中，取 20 μ 1进样，A相为水（含0· 1%甲酸），B相为乙腈（含0· 1%甲酸）。流速=lmL/min，紫外 271nm处检测，柱子为NUCLE0SIL100-5C18,仪器为安捷伦1260。洗脱梯度如下：
[0250]
[0251] 液相-质谱连用（LC-MS)与核磁共振（NMR)分析：
[0252] 若HPLC分析发现突变株能够产生新化合物，可以进一步将突变株的发酵提取液 用LC-MS检测新化合物的分子量和部分结构信息，再通过大量发酵分离纯化化合物进行 NMR分析，得到化合物完整的结构信息。（图8,图9)
[0253] 验证正确的基因敲除突变株与野生型同时进行发酵，发酵之后的提取液用HPLC 检测。HPLC结果能够反映基因的敲除是否对三欣卡辛的产生造成影响，以及基因敲除突变 株中是否有新化合物出现。WT :三欣卡辛产生菌野生型；
[0254] 图8-1 :敲除基因 txnO,产生突变株为mZM-0-1/2。该基因敲除后野生型的产量显 著下降，所以该边界基因与三欣卡辛生物合成基因簇相关。
[0255] 图8-2 :敲除基因 txn5,产生突变株为mZM-5-1/2。该基因缺失后没有完全中断三 欣卡辛的产生，只是产量有所下降。
[0256] 图8-3 :敲除基因 txnl4,产生突变株为mZM-14。该基因缺失后完全中断三欣卡辛 的产生。
[0257] 图8-4 :敲除基因 txnl2,产生突变株为mZM-12-1/2。该基因缺失后并不影响三欣 卡辛的生物合成，且产量没有太大的变化。
[0258] 图8-5 :敲除基因 txnl9,产生突变株为mZM-19-1/2。该基因敲除后不再产生三欣 卡辛，且有新化合物产生，但量很低，还在分离中。
[0259] 图8-6:敲除基因 txn20,产生突变株为mZM-20-1/2。该基因缺失后没有中断三欣 卡辛的生物合成，产量略有降低。
[0260] 图8-7 :敲除基因 txn-22,产生突变株为mZM-22-1/2。该基因敲除不影响三欣卡 辛的产生，且没发现明显的新峰出现。
[0261] 图8-8 :敲除基因 txn-23,产生突变株为mZM-23-1/2。该基因敲除也未发现有新 峰出现，且未影响三欣卡辛的生物合成。
[0262] 图8-9 :敲除基因 txn-25,产生突变株为mZM-25-1/2。该基因敲除未中断三欣卡 辛的合成，但其产量大大降低，且有新峰出现经分离纯化为色素的增加。
[0263] 图8-10 :敲除基因 txn-26,产生突变株为mZM-26-1/2。该基因缺失后，完全中断 野生型产生，发酵后色素很明显，非常红，HPLC显示有新化合物产生，但是峰型很杂，量都很 低，有待大量发酵分离。
[0264] 图8-11 :敲除基因 txn30,产生突变株为mZM-30-1/2。该基因缺失后，完全中断野 生型产生，HPLC显示有新化合物产生，且从基因型分析应该是与糖基合成相关的化合物，产 量挺高，有待大量发酵分离纯化。
[0265] 图8-12 :敲除基因 txn35,产生突变株为mZM-35-1/2。该基因缺失后，完全中断野 生型产生，HPLC显示有新化合物产生，但产量非常低，为分离纯化带来很大困难。
[0266] 图8-13 :敲除基因 txn42,产生突变株为mZM-42-1/2。该基因缺失后，基本上不影 响三欣卡辛AD的产生，HPLC显示也无化合物产生。
[0267] 实施例9产生新化合物的突变株的获得
[0268] 目前已经确定产新颖结构化合物的突变株包括有mZM-5,mZM-21，mZM-41，mZM-44， mZM-49, mZM-52,这其中前四个突变株分别为带有Marker的双交换突变株，构建的方法也 是采用实施例6中的方法（一），最终经过PCR验证正确的基因型后，与野生型对比发酵，在 HPLC图上发现有新的化合物峰出现。（图7)后两个则是采用实施例6中的方法（二），最 终拿到了不带Marker的同框敲除突变株，同样经过PCR验证后与野生型对比发酵，在HPLC 图上发现有新的化合物峰出现。
[0269] 实施例10新化合物的分离纯化和结构鉴定
[0270] 通过大量发酵（1L-4L不等）突变株，最终分离纯化到七个具有新颖结构的化合 物，分别是 Txn-5-l，Txn-5-2, Txn-21，Txn-41，Txn-44, Txn-49, Txn-52。（图 9)
[0271] 图9-1 :Α.敲除基因 txn4,产生突变株为mZM-4-1/2,分离纯化得新化合物 Txn-4-l，Txn-4-2 ;B. LC-MS-Txn-4-l/Txn-4-2 ;C:NMR-Txn-4-l/Txn-4-2 ;解析出 Txn-4-l、 Txn-4-2结构如下。
[0272]
[0273] 图9-2 :Α.敲除基因 txn21，产生突变株为mZM-21，分离纯化得新化合物Τχη-21， 与野生型对比HPLC图；Β:Τχη-21的MS数据；C:NMR-Txn-21/WT (新化合物与野生型的对比 图）及化合物的二维谱图；解析出Txn-21结构如下所示。
[0274]
[0275] 图9-3 :Α.敲除基因 txn41，产生突变株为mZM-41，分离纯化得新化合物Τχη-41， 与野生型对比HPLC图；Β:Τχη-41的MS数据；C :Τχη-41的核磁数据；综合上述数据，解析 出Τχη-41的结构为
[0276] 图9-4 :Α.敲除基因 txn 44,产生突变株为mZM-44,分离纯化得新化合物Τχη-44， 与野生型对比HPLC图；Β: Τχη-44的MS数据；C: Τχη-44的核磁数据（包括一维和二维谱
图）；综合上述数据，解析出Txn-44 j
[0277] 图9-5 :A.敲除基因 txn 49,产生突变株为mZM-49,分离纯化得新化合物Txn-49， 与野生型对比HPLC图；Β: Τχη-49的MS数据；C: Τχη-49与野生型对比的核磁数据（HNMR); 根据所有谱图分析，我们推出该化合物结构如下式所示，相比野生型在2号糖边链少了一 个乙酰基的化合物：
[0278] 图9-6 :Α.敲除基因 txn 52,产生突变株为mZM-52,分离纯化得新化合物Τχη-52， 与野生型对比HPLC图；Β: Τχη-52的MS数据；C: Τχη-52的核磁数据（包括一维和二维谱 图）；解析出Txn-52结构f
[0279] 其中化合物Txn-5-1，Txn-5-2,在发酵突变株mZM-5-升后，通过丙酮浸泡，乙酸 乙酯萃取等粗处理后，最终通过硅胶柱的纯化分离，以及凝胶柱的进一步纯化，共获得分别 为10mg，5mg的纯品，最终通过LC-MS及HNMR的谱图验证其结构的正确性。（图9-1)
[0280] 其中化合物Txn-21，在发酵突变株mZM-21两升后，通过丙酮浸泡，乙酸乙酯萃取 等粗处理后，最终通过硅胶柱的纯化分离，以及凝胶柱的进一步纯化，共获得分别为60mg 的纯品，最终通过LC-MS及HNMR的谱图验证其结构的正确性。（图9-2)
[0281] 其中化合物Txn-41，在发酵突变株mZM-41两升后，通过丙酮浸泡，乙酸乙酯萃取 等粗处理后，最终通过硅胶柱的纯化分离，以及凝胶柱的进一步纯化，共获得分别为20mg 的纯品，最终通过LC-MS及HNMR的谱图验证其结构的正确性。（图9-3)
[0282] 其中化合物Txn-44,在发酵突变株mZM-44两升后，通过丙酮浸泡，乙酸乙酯萃取 等粗处理后，最终通过硅胶柱的纯化分离，以及凝胶柱的进一步纯化，共获得分别为15mg 的纯品，最终通过LC-MS及HNMR的谱图验证其结构的正确性。（图9-4)
[0283] 其中化合物Txn-49,在发酵突变株mZM-49 -升后，通过丙酮浸泡，乙酸乙酯萃取 等粗处理后，最终通过硅胶柱的纯化分离，以及凝胶柱的进一步纯化，共获得分别为45mg 的纯品，最终通过LC-MS及HNMR的谱图验证其结构的正确性。（图9-5)
[0284] 其中化合物Txn-52,在发酵突变株mZM-52四升后，通过丙酮浸泡，乙酸乙酯萃取