等粗处理后，最终通过硅胶柱的纯化分离，以及凝胶柱的进一步纯化，共获得分别为30mg 的纯品，最终通过LC-MS及HNMR的谱图验证其结构的正确性。（图9-6)
[0285] 实施例11化合物及相关生物活性实验
[0286] 为验证化合物Txn-49的细胞毒性，我们将jurkat细胞株（属急性T细胞白血病 细胞系）作为本次细胞活性的测试菌株，与野生型化合物trioxacarcin A相对照来检测其 生物活性。
[0287] MTT 实验：
[0288] 将Jurkat细胞800rpm离心2分钟，弃上清，用培养基稀释成细胞悬液，调整 浓度至I X 105个/ml，50 μ 1/we11接种于96孔平底透明板中，将待测小分子（Txn-49、 trioxacarcin A)按不同浓度配制到培养基中，后加入到相应的孔中（50yl/well)，作用 48小时，加入20μ Ι/well的MTT(5mg/ml in PBS)作用4小时后，加入80μ Ι/well三联剂 (10%w/v SDS+5%iBu0H+0.0 lM HC1)，置于37oC下，12小时以上至紫色结晶完全溶解。用酶 标仪测定(?(Optical Density)值（检测波长550nm，参考波长650nm)。空白组为不加细 胞只加培养基，对照组为加入与化合物同体积的DMS0,计算细胞存活率=(实验组OD值-空 白组OD值V(对照组OD值-空白组OD值）。
[0289] 实验结果如图10所示，结果显示，在细胞菌株活性上，野生型的致死率要高一些， 化合物Txn-49相对于野生型的细胞致死性变弱，但细胞毒性降低。体外细胞毒性降低了一 个数量级，提示三欣卡辛的类似物（如Τχη-49)具有与三欣卡辛不同的细胞菌株活性。
[0290] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种三欣卡辛的生物合成基因簇，其特征在于，所述基因簇包括以下三欣卡辛生物 合成所涉及的56个基因： 1) 13 个II型聚酮合成酶PKS相关基因：即txn5_8,txnl3,txnl7,txnl9,txn27,txn36, txn39,txn41,txn43,txn46 ： txn5位于基因簇核苷酸序列第19560-17875位，编码酰基转移酶，长度为562个氨基 酸； txn6位于基因簇核苷酸序列第19990-19718位，编码酰基承载蛋白，长度为91个氨基 酸； txn7位于基因簇核苷酸序列第21275-20055位，编码链延伸因子，长度为407个氨基 酸； txn8位于基因簇核苷酸序列第22534-21272位，编码酮基合成酶，长度为421个氨基 酸； txnl3位于基因簇核苷酸序列第28909-27953位，编码芳香化酶，长度为319个氨基 酸； txnl7位于基因簇核苷酸序列第33234-34016位，编码酮基还原酶，长度为261个氨基 酸； txnl9位于基因簇核苷酸序列第35711-36748位，编码脱氢酶，长度为346个氨基酸； txn27位于基因簇核苷酸序列第45439-44318位，编码环氧水解酶，长度为374个氨基 酸； txn36位于基因簇核苷酸序列第55665-55138位，编码芳香环羟化双加氧酶亚基，长度 为176个氨基酸； txn39位于基因簇核苷酸序列第57618-58403位，编码短链脱氢酶，长度为262个氨基 酸； txn41位于基因簇核苷酸序列第58987-59901位，编码环化酶，长度为305个氨基酸； txn43位于基因簇核苷酸序列第61547-61101位，编码芳香环羟化双加氧酶亚基，长度 为149个氨基酸； txn46位于基因簇核苷酸序列第64276-63554位，编码氧化还原酶，长度为241个氨基 酸； 2) 4个负责起始单元合成相关基因；即txnl2,txnl4-16 ; txnl2位于基因簇核苷酸序列第27815-26076位，编码苹果酸辅酶A(CoA)合成酶，长度 为580个氨基酸； txnl4位于基因簇核苷酸序列第30020-28986位，编码3-氧代酰基-酰基承载蛋白 (ACP)合成酶，长度为345个氨基酸； txnl5位于基因簇核苷酸序列第31680-30049位，编码2-异苹果酸合酶，长度为544个 氨基酸； txnl6位于基因簇核苷酸序列第33014-31761位，编码酰基辅酶A转移酶，长度为418 个氨基酸； 3) 13个负责边链糖基合成相关基因，即txnl-4,txn28-32,txn42,45,49,50 ; txnl位于基因簇核苷酸序列第12861-13853位，编码dTDP-葡萄糖4, 6-脱水酶，长度 为331个氨基酸； txn2位于基因簇核苷酸序列第14848-13976位，编码dTDP葡萄糖合酶，长度为291个 氨基酸； txn3位于基因簇核苷酸序列第15503-16486位，编码丙酮酸脱氢酶a亚基，长度为 328个氨基酸； txn4位于基因簇核苷酸序列第16520-17557位，编码丙酮酸脱氢酶0亚基，长度为 346个氨基酸； txn28位于基因簇核苷酸序列第46543-45557位，编码NAD-己糖-4-酮基还原酶，长度 为329个氨基酸； txn29位于基因簇核苷酸序列第47181-46540位，编码dTDP-4-脱氧葡萄糖-3, 5-异构 酶，长度为214个氨基酸； txn30位于基因簇核苷酸序列第48428-47187位，编码NDP-己糖-3碳-甲基转移酶， 长度为414个氨基酸； txn31位于基因簇核苷酸序列第48662-50128位，编码NDP-脱氧葡萄糖-2, 3-脱水酶， 长度为489个氨基酸； txn32位于基因簇核苷酸序列第50125-51090位，编码NDP-己糖-3-酮基还原酶，长度 为322个氨基酸； txn42位于基因簇核苷酸序列第61080-59929位，编码糖基转移酶，长度为384个氨基 酸； txn45位于基因簇核苷酸序列第63460-62186位，编码糖基转移酶，长度为425个氨基 酸； txn49位于基因簇核苷酸序列第68041-66848位，编码酰基转移酶，长度为398个氨基 酸； txn50位于基因簇核苷酸序列第69353-68070位，编码糖基转移酶，长度为428个氨基 酸； 4) 13个负责复杂的三并元含氧螺环后修饰基因，即txn21,txn23_26，txn35,txn37,tx n40,txn44,txn47,txn51-53 ； txn21位于基因簇核苷酸序列第38405-37200位，编码p450细胞色素氧化酶，长度为 402个氨基酸； txn23位于基因簇核苷酸序列第40945-39710位，编码铁氧化还原蛋白，长度为412个 氨基酸； txn24位于基因簇核苷酸序列第41268-40945位，编码铁氧化还原蛋白，长度为108个 氨基酸； txn25位于基因簇核苷酸序列第41505-42989位，编码三肽氨基肽酶，长度为495个氨 基酸； txn26位于基因簇核苷酸序列第44290-43061位，编码p450细胞色素氧化酶，长度为 410个氨基酸； txn35位于基因簇核苷酸序列第55060-53840位，编码p450细胞色素氧化酶，长度为 407个氨基酸； txn37位于基因簇核苷酸序列第56938-55823位，编码氧化酶，长度为372个氨基酸；txn40位于基因簇核苷酸序列第58430-58966位，编码黄素还原酶类似的氧化还原酶， 长度为179个氨基酸； txn44位于基因簇核苷酸序列第61741-62106位，编码未知功能蛋白，长度为122个氨 基酸； txn47位于基因簇核苷酸序列第65379-64357位，编码氧甲基转移酶，长度为341个氨 基酸； txn51位于基因簇核苷酸序列第70423-69404位，编码氧甲基转移酶，长度为340个氨 基酸； txn52位于基因簇核苷酸序列第71697-70474位，编码p450细胞色素氧化酶，长度为 408个氨基酸； txn53位于基因簇核苷酸序列第72753-71731位，编码氧甲基转移酶，长度为341个氨 基酸； 5) 2个抗性基因，即txn33,txn38 ; txn33位于基因簇核苷酸序列第52661-51159位，编码抗性蛋白，长度为501个氨基 酸； txn38位于基因簇核苷酸序列第57431-56967位，编码抗性蛋白，长度为155个氨基 酸； 6) 7 个调苄基因，即txnO,txn9_ll,txnl8,txn34,txn55 ; txnO位于基因簇核苷酸序列第11766-12050位，编码LuxR家族调节因子，长度为93个 氨基酸； txn9位于基因簇核苷酸序列第23673-22882位，编码SARP家族调控因子，长度为264 个氨基酸； txnlO位于基因簇核苷酸序列第24216-25400位，编码双组份激酶，长度为395个氨基 酸； txnll位于基因簇核苷酸序列第25422-26033位，编码双组份激酶调节因子，长度为 204个氨基酸； txnl8位于基因簇核苷酸序列第34147-35649位，编码外排蛋白，长度为501个氨基 酸； txn34位于基因簇核苷酸序列第53757-52738位，编码转录因子调节蛋白，长度为340 个氨基酸； txn55位于基因簇核苷酸序列第74585-73725位，编码SARP家族调控因子，长度为287 个氨基酸； 7) 其他未知功能基因，即txn20,txn22,txn48,txn54 ; txn20位于基因簇核苷酸序列第37189-36809位，编码未知功能蛋白，长度为127个氨 基酸； txn22位于基因簇核苷酸序列第38570-39670位，编码未知功能蛋白，长度为367个氨 基酸； txn48位于基因簇核苷酸序列第66666-65500位，编码未知功能蛋白，长度为389个氨 基酸； txn54位于基因簇核苷酸序列第73004-73552位，编码未知功能蛋白，长度为183个氨 基酸。2. -种三欣卡辛的生物合成相关蛋白，其特征在于，所述的蛋白氨基酸序列选自如SEQ IDNO. : 2-57中任一所不的氨基酸序列。3. 三欣卡辛的生物合成相关基因，其特征在于，所述的合成相关基因编码权利要求2 所述的三欣卡辛的生物合成相关蛋白。4. 如权利要求1所述的三欣卡辛生物合成基因簇，或权利要求2所述的三欣卡辛生物 合成相关蛋白或蛋白组合的用途，其特征在于，用于催化合成三欣卡辛及类似物。5. -种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求1所述的三欣卡辛的生物 合成基因簇或权利要求3所述的三欣卡辛的生物合成相关基因。6. -种重组的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5所述的表达载体， 或其染色体上整合有外源的权利要求1所述的三欣卡辛的生物合成基因簇或权利要求3所 述的三欣卡辛的生物合成相关基因。7. -种产生三欣卡辛的方法，其特征在于，包括步骤：培养权利要求6所述的宿主细 胞，从而表达三欣卡辛；以及 分离出所述的三欣卡辛。8. -种突变菌株，其特征在于，所述的突变菌株是以产生三欣卡辛的菌株为原始菌株， 通过将所述原始菌株中的三欣卡辛生物合成基因簇中一个或多个基因失活而形成的突变 菌株。9. 一种权利要求8所述的突变菌株的用途，其特征在于，用于制备三欣卡辛类似物。10. -种三欣卡辛类似物，其特征在于，所述的三欣卡辛类似物通过以下方法制备： (1) 提供权利要求8所述的突变菌株； (2) 对步骤（1)所述的突变菌株进行培养，从而得到所述的三欣卡辛类似物。11. 如权利要求10所述的三欣卡辛类似物，其特征在于，所述的三欣卡辛类似物选自 下组：Txn-21、Txn-41,Txn-44、Txn-49、Txn-4-1、Txn-4-2、Txn-52 ;12. -种提高三欣卡辛产量的方法，其特征在于，包括步骤： 在吸附性材料存在下，培养三欣卡辛的生产菌，从而产生三欣卡辛；以及 从培养体系或培养物中分离所述的三欣卡辛； 较佳地，所述的吸附性材料是大孔树脂，更佳地，所述的吸附性材料是大孔树脂HP20。
【专利摘要】本发明涉及三欣卡辛的生物合成基因簇及其应用，具体地，本发明提供了一种三欣卡辛的生物合成基因簇，整个基因簇共包含56个基因：13个II型聚酮合成酶(PKS)相关基因；4个起始单元合成相关基因；13个糖基合成相关基因；13个特殊的后修饰基因；2个抗性基因；7个调节基因以及4个无明确功能的基因。通过对上述生物合成基因的遗传操作可阻断三欣卡辛的生物合成，或使其产量发生改变，或产生新的化合物。该基因簇可用于蒽醌类化合物的基因工程、蛋白表达、酶催化反应等，也可用于寻找和发现用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。
【IPC分类】C12N9/00, C12N15/52, C12P19/60, C12N1/21, C07K14/36, C12N15/63, C12P17/16, C12R1/465, C12N1/20
【公开号】CN104911196
【申请号】CN201410093394
【发明人】唐功利, 张媚, 潘海学
【申请人】中国科学院上海有机化学研究所
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2014年3月13日