介于0. 05至0. 25wt%之间的正丁醇的残留溶剂含量。在其它这样的实施 方案中，所述结晶游离碱具有< 〇. 5wt%的茴香醚及< 0. 5wt%的正丁醇，优选< 0. 25wt% 的茴香醚及< 0. 25wt%的正丁醇的残留溶剂含量。
[0092] 在上述各方法中，所述第一溶剂为醇且所述第二溶剂为芳族溶剂。适用的醇包括 但不局限于相对高沸点的醇，诸如正丁醇、叔丁醇、正丙醇、戊醇、1，4-丁二醇或丙二醇等。 适用的芳族溶剂包括但不局限于茴香醚、1，3, 5-三甲苯、间二甲苯、氯苯、吡啶等。
[0093] 在一些这样的实施方案中，所述溶剂混合物包含10%的醇、15%的醇、20%的醇、 25 %的醇、30 %的醇、35 %的醇、40 %的醇、45 %的醇、50 %的醇、60 %的醇、70 %的醇、或 >70%的醇，其余部分为芳族溶剂。在其它这样的实施方案中，所述溶剂混合物包含90%的 芳族溶剂、85 %的芳族溶剂、80 %的芳族溶剂、75 %的芳族溶剂、70 %的芳族溶剂、65 %的芳 族溶剂、60 %的芳族溶剂、55 %的芳族溶剂、50 %的芳族溶剂、40 %的芳族溶剂、30 %的芳族 溶剂、或〈30%的芳族溶剂，其余部分为醇溶剂。
[0094] 在一个优选的实施方案中，所述第一溶剂为正丁醇。在另一个优选的实施方案中， 所述第二溶剂为茴香醚。在特别优选的实施方案中，所述第一溶剂为正丁醇且所述第二溶 剂为茴香醚。在一些这样的实施方案中，所述溶剂混合物包含10 %的正丁醇/茴香醚、15 % 的正丁醇/茴香醚、20 %的正丁醇/茴香醚、25 %的正丁醇/茴香醚、30 %的正丁醇/茴香 醚、35 %的正丁醇/茴香醚、40 %的正丁醇/茴香醚、45 %的正丁醇/茴香醚、50 %的正丁醇 /茴香醚、60%的正丁醇/茴香醚、70%的正丁醇/茴香醚、或>70%的正丁醇/茴香醚。在 一些优选的实施方案中，所述溶剂混合物包含约20至约50 %的正丁醇/茴香醚。在特别优 选的实施方案中，所述溶剂混合物包含约40%的正丁醇/茴香醚。
[0095] 为了提高收率，所述方法可以包括加热或冷却至高于或低于室温的温度。经常地， 所述反应混合物可加热至约30°C至约150°C的温度，更常为约50°C至约120°C的温度以获 得溶解。在结晶期间，可能需要将所述反应混合物冷却至室温或低于室温的温度，例如介于 约0°C与约30°C之间，优选约5°C、约10°C、约15°C或约20°C。
[0096] 在另外的实施方案中，所述化合物1的游离碱为具有包含在衍射角 (2 0)10. 1±0. 2的峰的粉末X射线衍射图案的A型多晶型。在其它实施方案中，所述 晶型具有包含在衍射角（2 0)10. 1±0. 2及22. 5±0. 2的峰的粉末X射线衍射图案。在 该方面的其它实施方案中，所述晶型具有包含在衍射角（20)5. 1 ±0.2、10. 1 ±0.2及 22. 5±0. 2的峰的粉末X射线衍射图案。在另外的实施方案中，所述晶型具有包含在衍射 角（2 0)5. 1±0. 2、10. 1±0. 2、19. 7±0. 2及22. 5±0. 2的峰的粉末X射线衍射图案。在 再其它实施方案中，所述晶型具有包含在衍射角（2 0 )5. 1±0. 2、10. 1±0. 2、17. 1±0. 2、 19. 7±0. 2及22. 5±0. 2的峰的粉末X射线衍射图案。在另外的实施方案中，所述晶 型具有包含在衍射角（2 0 )5. 1±0. 2、10. 1±0. 2、11. 5±0. 2、17. 1±0. 2、19. 7±0. 2 及 22. 5±0. 2的峰的粉末X射线衍射图案。在再其它实施方案中，所述晶型具有包含在衍射角 (2 9 )5. 1±0. 2、10. 1±0. 2、11. 5±0. 2、17. 1±0. 2、18. 7±0. 2、19. 7±0. 2 及 22. 5±0. 2 的 峰的粉末X射线衍射图案。在该方面的一些实施方案中，所述晶型具有包含在实质上与图 1中所示相同的衍射角（2 0)的峰的粉末X射线衍射（PXRD)图案。
[0097] 游离碱A型多晶型的粉末X射线衍射（PXRD)图案显示于图1，且对应数据列表于 表1中。
[0098] 化合物1的A型多晶型的PXRD数据
[0099]
[0100] 化合物1的结晶游离碱A型的固态核磁共振（ssNMR)显示于图2中，且对应数据 列表于表2中。
[0101] 表2.化合物1的A型多晶型的以每百万之份数表示的13C化学位移
[0102]
L1N丄UOUUSdO/ A pyj丨>/ 丄
[0103] (a)参考29. 5ppm处的固相金刚烷的外部样品。
[0104] 在另一方面，本发明提供化合物1的结晶游离碱，其中该结晶游离碱为化合 物1游离碱的B型多晶型。在该方面的一些实施方案中，所述晶型具有包含在衍射角 (2 0 ) 6. 0 ± 0. 2的峰的粉末X射线衍射图案。在该方面的其它实施方案中，所述晶型具有 包含在衍射角（2 0)6. 0±0. 2及19. 8±0. 2的峰的粉末X射线衍射图案。在该方面的其 它实施方案中，所述晶型具有包含在衍射角（2 0 )6. 0±0. 2、19. 8±0. 2及26. 7±0. 2的峰 的粉末X射线衍射图案。在其它实施方案中，所述晶型具有包含在衍射角（2 0 )6. 0±0. 2、 16. 4±0. 2、19. 8±0. 2及26. 7±0. 2的峰的粉末X射线衍射图案。在再其它实施方案 中，所述晶型具有包含在衍射角（2 0 ) 6. 0±0. 2、12. 8±0. 2、16. 4±0. 2、19. 8±0. 2及 26. 7±0. 2的峰的粉末X射线衍射图案。在另外的实施方案中，所述晶型具有包含在衍射 角（2 9 )6. 0±0. 2、12. 8±0. 2、16. 4±0. 2、19. 8±0. 2、22. 6±0. 2 及 26. 7±0. 2 的峰的粉 末X射线衍射图案。在再其它实施方案中，所述晶型具有包含在衍射角（2 0)6. 0±0. 2、 10. 9±0. 2、12. 8±0. 2、16. 4±0. 2、19. 8±0. 2、22. 6±0. 2 及 26. 7±0. 2 的峰的粉末 X 射线 衍射图案。在该方面的一些实施方案中，所述晶型具有包含在实质上与图3所示相同的衍 射角（2 0)的峰的PXRD图案。游离碱B型多晶型的粉末X射线衍射（PXRD)图案显示于图 3中，且对应数据列表于表3中。
[0105] 表3 :化合物1的B型多晶型的PXRD数据
[0106]
[0107] 6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基）-8H-吡啶 并[2, 3-d]嘧啶-7-酮的结晶游离碱B型的固态核磁共振（ssNMR)显示于图4中，对应数 据列表于表4中。
[0108] 表4.化合物1的B型多晶型的以每百万之份数表示的13C化学位移
[0109]
[0110] (a)参考29. 5ppm处的固相金刚烷的外部样品。
[0111] (b)宽峰
[0112] 就各粉末X射线衍射测量而言，将游离碱的样品置入位于支架的平坦表面上的孔 穴，并使用载玻片整平该样品表面。将含有该等样品的支架置入衍射仪中，且X射线光束源 照射所述样品，最初以相对于所述支架的平坦表面的小角度照射。然后以逐步方式将所述 X射线光束移动通过弧，所述方式连续增加在入射光束与所述支架的平坦表面之间的角度。 在扫描的每一步，闪烁计数器检测被衍射的照射的量，其作为2 0 (° )的函数记录。仪器软 件显示所述扫描的被衍射的照射结果，其表示为强度对2 0 (° )。
[0113] 表1及表3分别列出了具有A型或B型多晶型的化合物1游离碱的显著PXRD峰 (即，展现峰高对噪声比大于3. 5峰）。所提供的特征峰列表不是唯一可能的特征峰列表。 多晶型鉴别领域中的技术人员可选择亦可将一种多晶型与另一种多晶型相区分的其它组 特征峰。
[0114] 在相同多晶型的单独测量中PXRD图案的差异可因许多原因引起。误差来源包括 样品制备中的变异（例如样品高度）、仪器误差、校准误差、以及操作者误差（包括确定峰位 置的误差）。优先定向（即，PXRD样品中缺乏晶体的随机定向）可造成相对峰高的显著差 异。校准误差及样品高度误差经常造成衍射图的全部峰向相同方向和以相同量偏移。在平 坦支架上的样品高度的小差异可能导致PXRD峰位置的大幅位移。系统研究显示1毫米的样 品高度差异可导致峰偏移高达1° 2 0，详见Chen等人，J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis(2001)26:63〇
[0115] 在许多情况中，由系统误差造成的衍射图案中的峰偏移可通过补偿该偏移（例如 对所有峰位置值应用校准因子）或通过再校准衍射仪来消除。通常，相同技术可用以补 偿衍射仪之间的差异，使得从两个不同仪器获得的PXRD峰位置能够一致。此外，当将这 些技术应用于来自相同或不同衍射仪的PXRD测量时，特定多晶型的峰位置经常一致在约 ±0. 2° 2 9 内。
[0116] 所公开的化合物包括所有药学上可接受的同位素变化形式。同位素变化形式是至 少一个原子被具有相同原子序数但原子质量与自然界中所发现的原子质量不同的原子置 换的化合物。可用的同位素包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟及氯的同位素。因此典型的同位素 包括但不局限于 2H、3H、13C、14C、15N、 170、ls0、32P、35S、1SF 及 36C1。
[0117] 所公开的化合物经诸如氘（即2H)取代可提供某些由较大代谢稳定性（例如活体 内半衰期增加或剂量需要减少）的治疗优点，因此在许多状况下可能更有用。此外，特定同 位素变化形式（例如结合放射性同位素）可用于药物和/或底物组织分布研究。从容易结 合及检测工具便利性的角度看，放射性同位素氚（即 3H)及碳14(即14C)特别有用。
[0118] 所公开的化合物的同位素变化形式通常可通过本领域技术人员已知的惯用技术 或通过与随后的实施例中所述方法类似的方法，使用适用试剂的适当同位素变化形式来制 备。所公开的化合物的药学上可接受的溶剂合物包括其中结晶的溶剂可被同位素取代（例 如D 20、d6_丙酮、d6-DMS0)的溶剂合物。
[0119] 溶解度实验
[0120] 美国专利第7, 345, 171号报道，通过传统盐断裂程序所制备的化合物1游离碱于 pH 7. 9下具有不良水溶解度（9 iig/mL)，且在动物研究中展现低生物利用度。报道指出所 述游离碱为其根据淤浆实验的最稳定晶体相（即，A型）。美国专利第7, 345, 171号的图17 提供了 A型的游离碱的水吸附/脱附等温线。如先前所述，该材料对应于本申请中所述的 小粒径化合物1游离碱。
[0121] 化合物1游离碱（A型）在药物粒子制备程序中具有高度冲压黏附倾向。由于冲压 黏附与API表面积相关，故API粒径控制是最小化药物产品制备期间的黏附的关键。除了 冲压黏附问题外，还发现从标准盐断裂程序直接分离的化合物1游离碱极容易产生静电， 且发现形成不能通过筛分进行分散的大的（大约500微米）硬聚结物。通过现有羟乙磺酸 盐API的游离碱化或通过中和在API合成最终步骤中所形成的原位盐产生具有相似不良物 理性质的游离碱API。在任一方法中，因由调整pH产生溶解性剧烈改变导致的快速结晶而 产生小API初级粒子。在所有情况下，所述游离碱作为更稳定A型多晶型分离。
[0122] 图6显示通过上述游离碱化及中和实验所形成的典型小初级粒子的扫描电子显 微术（SEM)图像。通过此游离碱分离方法所产生的一批化合物1(A型）的粒径分布测量提 供于图8中。该粒径分布中的第二模式由大聚结物的存在导致，在图6中的SEM图像亦可 看到它。改变所述游离碱化方法的尝试在改善所产生的API的物理性质方面未能成功。因 为所述产生游离碱的方法造成具有不良物理性质的API的分离，进行了研究以鉴别能改善 API物理性质的再结晶方法。
[0123] 完成了化合物1游离碱的早期结晶筛选实验以鉴别容许分离具有改良的物理性 质的粒子的溶剂系统。溶解度筛选与小规模再结晶研究的组合检验了多种可能的溶剂系 统。
[0124] 小规模结晶研究
[0125] 进行了一系列小规模结晶实验以鉴别可能的再结晶溶剂系统以及评估溶剂对于 所分离的游离碱初级粒子的形状的影响。以l〇mg模规进行了最初一组14个筛选研究，其 使用密封管及外部热源以将50mg/mL样品加温高至回流温度。目视观察鉴别成为溶液的样 品，且使用照相显微术来表征所产生的粒子。这些初始结晶筛选实验的结果汇总于表5中。
[0126] 表5 :来自初步小规模结晶研究的结果概要
[0127]
[0128]
[0129] 基于这些小规模结晶研究，由于所产生的粒子大且茴香醚为ICH第III类溶剂，茴 香醚成为额外结晶及溶解度研究的焦点。基于所产生的粒子，此筛选研究亦将吡啶、间二甲 苯及1，3, 5-三甲苯鉴别为可能的溶剂系统，但这些溶剂中无一亦具有类似于茴香醚的ICH 第III类列表。
[0130] 以下溶剂亦一直用于固体的再结晶：异丙醇、异丁醇、乙醇、乙酸乙酯、甲苯、四氢 呋喃及二:您：烧。所述溶剂各产生化合物1的A型多晶型结晶固体，其与从二氯甲烷获得的 原始晶型相同。
[0131] 溶解度研究：
[0132] 与初始小规模结晶研究平行，对化合物1游离碱进行了一系列溶解度研究以鉴别 可能的再结晶系统。在初始室温溶解度筛选研究中，筛选了总计23种溶剂。此研究显示出 化合物1游离碱在一系列有机溶剂中具有低溶解度，只有二氯甲烷显示出大于lmg/mL的溶 解度（3.0mg/mL)。进行了随后的靶向较高温度溶解度研究。在追踪研究中，在25mg/mL的 固定浓度下检验了一组16种溶剂系统，且使用直到110°C的最大温度的动力学溶解度方法 测量了溶解温度。
[0133] 将通过化合物1的COSMOtherm溶解度模型预测的协同溶解度行为用于选择此 筛选研究中包括的二元及三元溶剂系统。这些研究的结果列于表6中。就该表中所列为 >110°C的实验而言，当加热至110°C时，化合物1不溶解于所述溶剂中，这表明在此溶剂中 于110°C下溶解度低于25mg/mL。
[0134] 表6. 25mg/mL化合物1游离碱溶液的动力学溶解度测量
[0135]
[0136] 来自表6中的实验編号3及編号11的饱和浴液的随后UPLC/MS测试显示存在先 前未看到的杂质峰，此表明这些实验中发生了降解。
[0137] 虽然丙二醇/n-BuOH/茴香醚混合物显示出相比于n-BuOH/茴香醚混合物而言改 良的溶解度，但前者溶剂系统因其可能造成规模化问题的高粘度及沸点导致与丙二醇一起 操作的潜在挑战，故不推行。
[0138] 基于这些筛选研究，鉴于API的相对高溶解度、化学稳定性及再结晶化合物1API 的粒子性质，选择40%的正丁醇与茴香醚的混合物作为用以进一步处理的结晶溶剂系统。 此溶剂系统用于随后生产以提供较大原生粒径API，该较大原生粒径API的黏附减少、不易 产生静电及无聚结物。
[0139] 使用此溶剂混合物，在使用受控冷却曲线及晶种引发成核而结晶之前，通过加热 至95至100°C，以40mL/g溶剂溶解化合物1 (浓度为25mg/mL)。图9为使用此再结晶程序 再结晶的化合物1的实验室规模批次的PLM图像，而图7显示三批再结晶的API的粒径分 布。此再结晶过程导致具有较大原生粒径的化合物1API粒子的分离，较大原生粒径导致在 药物产品生产过程中的黏附倾向性降低。此再结晶的化合物1API不形成聚结物，且亦具有 不易产生静电的正面贡献。
[0140] 溶解度筛选与小规模再结晶研究的组合检验了多种用于再结晶化合物1游离碱 的可能溶剂系统。基于这些筛选研究的结果，基于所述API的相对高溶解度、化学稳定性及 再结晶化合物1的粒子性质，选择40%的正丁醇/茴香醚的混合物作为优选的结晶溶剂系 统。从该再结晶过程分离的API的较大粒径及改良的粒子性质促进了化合物1游离碱的药 物产品生产过程的发展。
[0141] 粒径评估
[0142] 使用激光衍射法评估了再结晶材料的粒径。激光衍射由包括ISO及ASTM的标准 及指导机构认可，且广泛用以测定粒径分布。在进行评估中，使样品通过导致在一定范围角 度散射的激光的激光束。以固定角度放置的检测器测量该位置所散射的光强度。然后应用 数学模型（Mie或Fraunhoffer理论）产生粒径分布。
[0143] 使用激光衍射（或小角度光散射）技术，通过用压缩空气分散干燥样品粉末来分 析粒径。特别的是，使用配备有Vibri干粉进料器的Sympatec HELOSR0D0S系统来分析粒 径分布。该粉末样品以0. 5巴的分散压力来分散。在一些情况中，使用Aspiros微定量给 料装置，且以0. 2巴的分散压力分散粉末样品。选择适用的透镜以涵盖每个样品的粒径范 围。
[0144] 在粒径测定中，将中位值定义为一半群体停留在此点上方及一半停留在此点下方 的值。就粒径分布而言，该中位数称为D50。该D50为将分布分成一半在此直径上方且一半 在此直径下方的以微米计的尺寸。Dv50或D[v，0.5]的表达方式有时用于体积分布的中位 数。
[0145] 所述模式是频率分布的峰。粒子分布可包括超过一个模式，例如粒子作为初级粒 子及聚结物存在的情况。
[0146] 跨距有时用作分布宽度的测量，且定义为（D[v，0.9]-D[v，0. 1])/D[v，0. 5]或 (D90-D10)/D50 的比。
[0147] 所述分布宽度亦可通过引用在x轴上的一、二或优选三个值，通常为D10、D50及 D90的一些组合，来表征。中位数D50已于上文定义为一半群体位于此值下方的直径。类似 地，分布的90%位于D90下方，及群体的10%位于D10下方。
[0148] 术语D[4, 3]是指体积平均或质量矩平均值。激光衍射结果以体积为基础报告，且 体积平均值可用以定义分布的中心点。D[4, 3]值对于分布中大粒子的存在是敏感的。
[0149] 制剂
[0150] 本发明还涉及包含本申请中所述化合物1的游离碱A型多晶型的药物组合物。本