表达盒子Dual-Casp9的片段的所述第二多克隆位点插入第二目的基因，得到携带有目 的基因的慢病毒表达载体；
[0032] 将所述携带有目的基因的慢病毒表达载体、pMDLg/pRRE载体、pRSV-Rev载体和 pMD-G载体按照摩尔比为2 :1 :1 :1混合后转染到293FT细胞中，转染后4h~6h更换为完 全培养基培养，48h后收集培养液，离心后保留上清并将所述上清用0. 45μm过滤头过滤， 保留滤液，所述滤液即为重组慢病毒的溶液。
[0033] 在一个实施例中，还包括在得到所述重组慢病毒的溶液后，对所述重组慢病毒的 溶液的滴度进行检测的步骤，具体为：
[0034] 第一天，将293FT细胞接种到多孔板中，每个孔接种2X105个细胞，每个孔加入 500μL培养基，37 °C、5 %C02培养过夜；
[0035] 第二天，按所述重组慢病毒的溶液的稀释比例为1、101、ΙΟ2、ΙΟ3、ΙΟ4、ΙΟ5、ΙΟ6、107 和1〇8,用培养基将所述重组慢病毒的溶液梯度稀释，接着分别将100μL梯度稀释的所述重 组慢病毒的溶液与100μL多孔板中的细胞培养液在多孔板的不同孔中混合转染，转染开 始后24h，吸去培养基并换成500μL含5UDNasel的新鲜培养基，37°C下培养30min以去除 可能附着于细胞表面的残余质粒DNA，然后将培养基换成lmL正常培养基，继续培养48h;
[0036] 第四天，吸去所述多孔板的每个孔中的培养基，加入500μL胰酶-EDTA溶液消化 细胞，在37°C反应1分钟，接着加入培养基终止消化反应并将细胞吹洗下，离心收集每个孔 的细胞，抽提每孔细胞的总RNA，接着逆转录得到每孔细胞的总cDNA;以及 [0037] 分别对得到的所述每孔细胞的总cDNA进行荧光定量PCR，得到每孔细胞的Ct值， 选择与对照组Ct值差异最小但超过2的实验组，得到其稀释倍数，按照以下公式计算慢病 毒滴度：
[0038]T=RX20X103,其中，T为慢病毒滴度，T的单位为TU/mL，R为稀释倍数。
[0039] 这种慢病毒表达载体利用2A肽实现双外源基因在哺乳动物细胞内的表达，2A肽 具有"自我剪切"的特性，在蛋白质的翻译过程中，2A肽改变了核糖体的活性，促进2A肽残 基Gly与tRNAsly2间酯链的水解，从转录复合物上释放上游多肽的同时又起始下游多肽的 翻译，在翻译水平上实现的双基因表达。据研究，2A肽能几乎实现完全剪切。因此，这种慢 病毒表达载体可以从理论上保证了双外源基因在哺乳动物细胞内的等量表达，相对于传统 的用于双基因表达的慢病毒载体，这种慢病毒表达载体的双基因表达效果较好。
【附图说明】
[0040] 图1为一实施方式的慢病毒表达载体的结构示意图；
[0041]图2为如图1所示的慢病毒表达载体的制备方法的流程图；
[0042] 图3为实施例6中流式细胞术检测TCR在⑶4+T淋巴细胞表面表达情况的结果；
[0043] 图4为实施例6中流式细胞术检测TCR在⑶8+T淋巴细胞表面表达情况的结果；
[0044] 图5为实施例7中流式细胞术检测人工诱导细胞凋亡的结果示意图。
【具体实施方式】
[0045] 下面主要结合附图及具体实施例对慢病毒表达载体及其制备方法和应用、重组慢 病毒的制备方法作进一步详细的说明。
[0046] 本发明中未说明的药品、试剂均为本领域商用产品（购自生工生物工程（上海） 股份有限公司、宝生物工程（大连）有限公司、德国QIAGEN公司、美国LifeTechnologies 公司、美国GIBC0公司等），未说明的操作均采用本领域常规方法，具体步骤可参见： ((MolecularCloning:ALaboratoryManual)) (Sambrook,J. ,Russell,Davidff.,Molecular Cloning:ALaboratoryManual, 3rdedition, 2001,NY,ColdSpringHarbor)〇
[0047] 如图1所示的一实施方式的慢病毒表达载体，为pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual.WPRE 载体。pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual.WPRE载体为pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体的GFP序 列被替换为带有自杀开关的双基因表达盒子Dual_Casp9得到。
[0048]pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体由购自addgene的商业化的质粒pRRLSIN. cPPT.PGK/GFP.WPRE改造而来，将质粒pRRLSIN.cPPT.PGK/GFP.WPRE的PGK启动子换成了 MSCV启动子即可。
[0049]GFP序列被替换具有如下优点：1、替换GFP可以容纳更大的外源基因（GFP基因本 身也有超过700bp的序列）；2、GFP所在位置正好处于MSCV启动子之后，将其替换可以提高 外源基因的表达水平。
[0050]pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体的GFP序列可以采用AscI内切酶和Sal I内切酶切除，然后用T4DNA连接酶将经过相同处理的带有自杀开关的双基因表达盒子 Dual-Casp9的片段和切除了GFP序列的pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体连接，构建得到 上述pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual-Casp9.WPRE载体。
[0051] 带有自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9包括从5'到3'端依次排列的如 下结构：第一多克隆位点-第一弗林蛋白酶切割位点-V5标签-第一Spacer-第一 2A 肽-Casp9_第二多克隆位点，其中，代表连接。
[0052] 自杀开关Casp9可以实现人工诱导的细胞凋亡，Casp9包括从5'到3'端依次排 列的如下结构：iCasp9-第二弗林蛋白酶切割位点-第二Spacer-第二2A肽。
[0053]iCasp9包括一个带有F36V变异的FK506结合蛋白12 (FKBP12)和经修饰的 Caspase-9蛋白。野生型的FKBP12与化合物AP1903或AP20187的亲和力很低，而带F36V 突变的FKBP12则可以很好地与这两种化合物结合，实现iCasp-9元件的二聚化，进而活化 其中的Caspase-9,起始细胞凋亡的过程。
[0054] 优选的，iCasp9的序列如SEQIDNo. 1所示。
[0055] 这种慢病毒表达载体利用2A肽实现双外源基因在哺乳动物细胞内的表达，2A肽 具有"自我剪切"的特性，在蛋白质的翻译过程中，2A肽改变了核糖体的活性，促进2A肽残 基Gly与tRNAsly2间酯链的水解，从转录复合物上释放上游多肽的同时又起始下游多肽的 翻译，在翻译水平上实现的双基因表达。据研究，2A肽能几乎实现完全剪切。因此，这种慢 病毒表达载体可以从理论上保证了双外源基因在哺乳动物细胞内的等量表达，相对于传统 的用于双基因表达的慢病毒载体，这种慢病毒表达载体的双基因表达效果较好。
[0056] 优选的，带有自杀开关的双基因表达盒子Dual_Casp9的序列如SEQIDNo.2所 不。
[0057] 第一多克隆位点包括从5'到3'端依次排列的如下结构：AscI酶切位点、BstBI 酶切位点、BamHI酶切位点和AgeI酶切位点。
[0058] 第二多克隆位点包括从5'到3'端依次排列的如下结构：XhoI酶切位点、SpeI 酶切位点、XmaI酶切位点和SalI酶切位点。
[0059] 优选的，第一多克隆位点的序列如SEQIDNo. 3所示。
[0060] 优选的，第二多克隆位点的序列如SEQIDNo. 4所示。
[0061] 优选的，第一弗林蛋白酶切割位点和第二弗林蛋白酶切割位点的序列如SEQID No. 5所示。
[0062] 优选的，V5标签的序列如SEQIDNo.6所示。
[0063] 优选的，第一Spacer和第二Spacer的序列如SEQIDNo.7所示。
[0064] 优选的，第一2A肽和第二2A肽的序列选自SEQIDNo. 8所示的序列、SEQIDNo.9 所示的序列、SEQIDNo. 10所示的序列和SEQIDNo. 11所示的序列中的一种，第一 2A肽 和第二2A肽的序列彼此不同。
[0065] 第一 2A肽和第二2A肽的序列彼此不同，可以避免被同源重组掉。
[0066] 在实际应用中，第一多克隆位点插入有第一目的基因，第二多克隆位点插入有第 二目的基因。
[0067]优选的，第一目的基因为小鼠TCRa基因，小鼠TCRa基因的NCBI编号为 DQ452619,第二目的基因为小鼠TCR0基因，小鼠TCR0基因的NCBI编号为DQ452620。 [0068] 本发明还提供了一种慢病毒表达试剂盒，包括上述的慢病毒表达载体。
[0069] 与现有技术相比，这种慢病毒表达试剂盒具有使用方便、高效，可很好地实现哺乳 动物细胞双外源基因的高效表达，而且可以容纳更多的基因片段，可作为有力的工具应用 于科研和产业界，如肿瘤的细胞免疫治疗。细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的抗 肿瘤疗法，弥补了传统的手