工诱导细胞凋亡，进而说明借 助pRRLSIN. cPPT. MSCV-Dual-Casp9. WPRE载体可以实现细胞的人工诱导凋亡。
[0142]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种慢病毒表达载体，其特征在于，所述慢病毒表达载体为pRRLSIN.cPPT. MSCV-Dual-Casp9.WPRE载体，所述pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual-Casp9.WPRE载体为 pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体的GFP序列被替换为带有自杀开关的双基因表达盒子 Dual_Casp9 得到； 所述带有自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9包括从5'到3'端依次排列的如 下结构：第一多克隆位点-第一弗林蛋白酶切割位点-V5标签-第一Spacer-第一 2A 肽-Casp9_第二多克隆位点，其中，代表连接； 所述Casp9包括从5'到3'端依次排列的如下结构：iCasp9-第二弗林蛋白酶切割位 点-第二Spacer-第二2A妝。2.根据权利要求1所述的慢病毒表达载体，其特征在于，所述iCasp9的序列如SEQID No. 1所示。3. 根据权利要求1所述的慢病毒表达载体，其特征在于，所述带有自杀开关的双基因 表达盒子Dual_Casp9的序列如SEQID No.2所示。4. 根据权利要求1所述的慢病毒表达载体，其特征在于，所述第一多克隆位点的序列 如SEQIDNo. 3 所示； 所述第二多克隆位点的序列如SEQIDNo. 4所示； 所述第一弗林蛋白酶切割位点和所述第二弗林蛋白酶切割位点的序列均如SEQID No. 5所示； 所述V5标签的序列如SEQIDNo. 6所示； 所述第一Spacer和所述第二Spacer的序列如SEQ IDNo. 7所示； 所述第一 2A肽和所述第二2A肽的序列选自SEQIDNo. 8所示的序列、SEQIDNo. 9 所示的序列、SEQIDNo. 10所示的序列和SEQIDNo. 11所示的序列中的一种，所述第一 2A 肽和所述第二2A肽的序列彼此不同。5. 根据权利要求1所述的慢病毒表达载体，其特征在于，所述第一多克隆位点插入有 第一目的基因，所述第二多克隆位点插入有第二目的基因； 所述第一目的基因为小鼠TCRa基因，所述小鼠TCRa基因的NCBI编号为DQ452619， 所述第二目的基因为小鼠TCRβ，所述小鼠TCRβ基因的NCBI编号为DQ452620。6. -种如权利要求1~5中任一项所述的慢病毒表达载体的制备方法，其特征在于，包 括如下步骤： 设计带有自杀开关的双基因表达盒子Dual_Casp9,并委托合成所述带有自杀开关 的双基因表达盒子Dual-Casp9，得到含有pUC-Dual-Casp9质粒的大肠杆菌菌液，所述 pUC-Dual-Casp9质粒中含有所述带有自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9,所述带有 自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9包括从5'到3'端依次排列的如下结构：第一多克 隆位点-第一弗林蛋白酶切割位点-V5标签-第一Spacer-第一 2A肽-Casp9-第二多克隆 位点，其中，代表连接，所述Casp9包括从5'到3'端依次排列的如下结构：iCasp9-第 二弗林蛋白酶切割位点-第二Spacer-第二2A肽； 将所述含有pUC-Dual-Casp9质粒的大肠杆菌菌液跟选择性LB液体培养基混合，在 37°C恒温摇床中300rpm培养12h~16h至0D6。。为0. 6~0. 8,将得到的菌液离心后保留第 一沉淀，将所述第一沉淀裂解后提取所述pUC-Dual-Casp9质粒； 在37°C下用AscI内切酶和SalI内切酶处理pUC-Dual-Casp9质粒，充分反应后回 收，得到所述带有自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9的片段； 在37°C下用AscI内切酶和SalI内切酶处理pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体，将 所述pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体的GFP序列切除，充分反应后回收，得到线性化的 pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体； 按照摩尔比为3~10 :1将所述带有自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9的片段 与所述线性化pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体混合，再加入T4DNA连接酶，4°C下连接过 夜，得到含有连接质粒的连接产物；以及 将所述含有连接质粒的连接产物转化感受态ToplO大肠杆菌，并均匀涂布到选择性的LB平板上，37°C倒置培养12h~16h，挑取阳性菌落置于所述选择性LB液体培养基中，在 37°C恒温摇床中300rpm培养12h~16h至0D6。。为0. 6~0. 8,将得到的菌液离心后保留第 二沉淀，将所述第二沉淀裂解后提取所述连接质粒，所述连接质粒即为所述慢病毒表达载 体。7. 根据权利要求6所述的慢病毒表达载体，其特征在于，还包括在得到所述带有自杀 开关的双基因表达盒子Dual-Casp9的片段之后，在所述带有自杀开关的双基因表达盒子 Dual-Casp9的片段的所述第一多克隆位点插入第一目的基因，在所述带有自杀开关的双基 因表达盒子Dual-Casp9的片段的所述第二多克隆位点插入第二目的基因的操作； 所述第一目的基因为小鼠TCRa基因，所述小鼠TCRa基因的NCBI编号为DQ452619， 所述第二目的基因为小鼠TCRf3基因，所述小鼠TCRf3基因的NCBI编号为DQ452620。8. -种慢病毒表达试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1~5中任一项所述的慢病毒 表达载体。9. 一种重组慢病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 提供如权利要求1~5中任一项所述的慢病毒表达载体，并在所述带有自杀开关的 双基因表达盒子Dual-Casp9的片段的所述第一多克隆位点插入第一目的基因，在所述带 有自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9的片段的所述第二多克隆位点插入第二目的基 因，得到携带有目的基因的慢病毒表达载体； 将所述携带有目的基因的慢病毒表达载体、pMDLg/pRRE载体、pRSV-Rev载体和pMD-G载体按照摩尔比为2 :1 :1 :1混合后转染到293FT细胞中，转染后4h~6h更换为完全培养 基培养，48h后收集培养液，离心后保留上清并将所述上清用0. 45μm过滤头过滤，保留滤 液，所述滤液即为重组慢病毒的溶液。10. 根据权利要求9所述的重组慢病毒的制备方法，其特征在于，还包括在得到所述重 组慢病毒的溶液后，对所述重组慢病毒的溶液的滴度进行检测的步骤，具体为： 第一天，将293FT细胞接种到多孔板中，每个孔接种2X105个细胞，每个孔加入500μL培养基，37°C、5%C02培养过夜； 第二天，按所述重组慢病毒的溶液的稀释比例为1、101、1〇2、1〇 3、1〇4、1〇5、1〇6、1〇7和1〇 8， 用培养基将所述重组慢病毒的溶液梯度稀释，接着分别将100μL梯度稀释的所述重组慢 病毒的溶液与1〇〇μL多孔板中的细胞培养液在多孔板的不同孔中混合转染，转染开始后 24h，吸去培养基并换成500yL含5UDNasel的新鲜培养基，37°C下培养30min以去除可能 附着于细胞表面的残余质粒DNA，然后将培养基换成lmL正常培养基，继续培养48h; 第四天，吸去所述多孔板的每个孔中的培养基，加入500μL胰酶-EDTA溶液消化细胞， 在37°C反应1分钟，接着加入培养基终止消化反应并将细胞吹洗下，离心收集每个孔的细 胞，抽提每孔细胞的总RNA，接着逆转录得到每孔细胞的总cDNA;以及 分别对得到的所述每孔细胞的总cDNA进行荧光定量PCR，得到每孔细胞的Ct值，选择 与对照组Ct值差异最小但超过2的实验组，得到其稀释倍数，按照以下公式计算慢病毒滴 度： T=RX20X103,其中，T为慢病毒滴度，T的单位为TU/mL，R为稀释倍数。
【专利摘要】本发明公开了一种双基因表达效果较好的慢病毒表达载体及其制备方法和应用、重组慢病毒的制备方法。该慢病毒表达载体为pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体的GFP序列被替换为带有自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9得到；带有自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9包括从5’到3’端依次排列的如下结构：第一多克隆位点-第一弗林蛋白酶切割位点-V5标签-第一Spacer-第一2A肽-Casp9-第二多克隆位点。这种慢病毒表达载体利用2A肽实现双外源基因在哺乳动物细胞内的表达，可以从理论上保证了双外源基因在哺乳动物细胞内的等量表达，相对于传统的用于双基因表达的慢病毒载体，这种慢病毒表达载体的双基因表达效果较好。
【IPC分类】C12N7/01, C12N15/66, C12N15/867
【公开号】CN105420276
【申请号】CN201510953306
【发明人】杨世成, 毛侃琅
【申请人】深圳精准医疗科技有限公司
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月17日