达盒的第一多克隆位点和第一Spacer之间 插入第一弗林蛋白酶切位点（SEQIDNo. 5)，可以使第一 2A肽上游的多肽在表达后再经弗 林蛋白酶的切割，其末端仅会残留4个氨基酸残基。出乎意料的，外源基因的表达水平又有 了进一步的提尚。
[0107] 最优地，在上一步得到的双基因表达盒的第一弗林蛋白酶切位点和第一Spacer 之间插入V5标签（SEQIDNo. 6)能再次提升外源基因的表达水平，实现双外源基因的最高 效等量表达。
[0108] 如图1所示，最终得到的双基因表达盒的序列如SEQIDNo. 2所示。
[0109]实施例 2pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual-Casp9.WPRE载体的构建。
[0110] 委托上海生工生物工程技术服务有限公司对带有自杀开关的双基因表达盒子 Dual-Casp9的序列进行合成，得到的序列包含在大肠杆菌体内的pUC-Dual-Casp9载体中。 对该大肠杆菌进行扩大培养，并提取其中的pUC-Dual-Casp9载体，然后测定其纯度和浓 度，结果如下表所示。
[0111]pUC-Dual-Casp9质粒的纯度和浓度
[0112]
[0113]用AscI和Sail分别对pUC-Dual_Casp9 载体和pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP. WPRE载体进行双酶切，电泳后分别回收重pUC-Dual-Casp9载体酶切产物中的小片段以及 pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体酶切产物的大片段。按pUC-Dual-Casp9载酶切产物的 小段：线性化的pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体的摩尔比为3:1混匀后，并加入T4DNA 连接酶，置于4 °C连接过夜。
[0114] 将连接产物转化感受态ToplO大肠杆菌，并均匀涂布到含100μg/mL氨苄青霉 素的LB平板上。37°C倒置培养12-16h。挑取多个阳性菌落，分别置于5mLLB液体培养 基（含l〇〇yg/mL氨苄青霉素）中，于恒温空气摇床上37°C，300rpm培养12-16h至0D6M =0. 6-0. 8,将得到的菌液置于离心机中，lOOOOrpm离心lmin，弃上清，获得所需菌体，并进 行测序，测序验证后提取其中的质粒。测序结果与预期完全相符，说明成功构建pRRLSIN. cPPT.MSCV-Dual-Casp9.WPRE载体。
[0115] 实施例3表达小鼠靶向黑色素瘤相关抗原gpl00(154_162)TCRa和TCRi3的载体 构建
[0116] 根据NCBI中提供的基因序列（TCRa和TCRβ，编号分别为DQ452619和 DQ452620)，并在TCRa基因的上下游分别加入AscI和AgeI酶切位点，并去除其终止密 码子；TCRi3基因的上下游分别加入XhoI和SalI酶切位点。委托上海生工生物工程技 术服务有限公司进行合成。
[0117] 合成获得两株大肠杆菌，分别包含pUC57_TCRa和PUC57-TCR0载体。对这两株 大肠杆菌进行扩大培养，分别提取其中的PUC57-TCRa和PUC57-TCRβ载体，然后测定其纯 度和浓度，结果如下表所示。
[0118]pUC57_TCRa和pUC57_TCR0载体的纯度和浓度
[0119]
[0120] 用AscI与AgeI酶对pUC57_TCRa载体进行处理，XhoI和SalI酶对 pUC57-TCRf3载体进行处理，电泳后分别回收获得两者的小片段TCRa和TCRf3。对上一 步获得的pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual-Casp9.WPRE载体用AscI与AgeI酶进行双酶切处 理，电泳后回收载体，然后用T4DNA连接酶将其与TCRa进行连接，获得pRRLSIN.cPPT. MSCV-Dual-Casp9.WPRE-TCRa载体。用MCSI上游引物（SEQIDNo. 12)和MCSI下游引 物（SEQIDNo. 13)进行测序，结果与预期完全相符。
[0121]用XhoI和SalI酶对pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual-Casp9.WPRE-TCRa载体进行 双酶切处理，电泳后回收载体，然后用T4DNA连接酶将其与TCRa进行连接，获得pRRLSIN. cPPT.MSCV-Dual-Casp9.WPRE-TCRa-TCR0 载体。用MCSII上游引物（SEQIDΝο·14)和 MCSII下游引物（SEQIDNo. 15)进行测序，结果与预期完全相符。至此，用于表达小鼠靶 向黑色素瘤相关抗原gpl〇〇 (154-162)TCRa和TCR0 的pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual-Casp9. WPRE-TCRa-TCRP载体已成功构建完成。
[0122] 实施例4慢病毒包装
[0123] 培养293FT细胞，取生长状态良好的细胞接种到10cm培养皿中，每个皿接种 5X106个细胞，加入DMEM无双抗培养基培养细胞约18h后至融合度达到80-90 %后，取 pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual-Casp9.WPRE-TCRa-TCRP载体 10μg、pMDLg/pRRE、pRSV-Rev和 pMD-G载体各5μg，用Lipofectamine2000转染至293FT细胞中，转染后4-6h更换成DMEM 完全培养基。48h后收集含病毒的上清培养基，6000g离心10min后，取上清液再用0. 45μm 过滤头进行过滤，获得病毒液。
[0124] 实施例5慢病毒滴度的检测
[0125] 培养293FT细胞，取生长状态良好的293FT细胞接种到24孔板中，每个孔接种 2X105个细胞，加入500yL培养基，37°C，5% 0)2培养过夜。第二天，按病毒原液：培养 基的稀释比例为1〇°-1〇8分别制备病慢毒梯度稀释液各100yL，然后吸取各孔原培养基各 100μL，再加入慢病毒稀释液各100μL开始转染。转染开始后24h，吸出含慢病毒的培养 基，换成500μL含5UDNaseI的新鲜培养基，37°C下培养30min以去除可能附着于细胞表面 的残余质粒DNA。然后将培养基换成lmL正常培养基，继续培养48h。
[0126] 小心吸走每个孔的全部培养基，加入500μL胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37 °C反 应1分钟。接着加入培养基终止消化反应并将细胞吹洗下，离心收集每个孔的细胞。抽提 每孔细胞的总RNA，接着逆转录为cDNA。以MCSI上游引物和MCSII下游引物分别为上下游 引物，按照下表加样：
[0129] 然后进行荧光定量PCR，获取各孔细胞荧光定量PCR反应的Ct值。反应条件如下：
[0130] 预变性：95°C30秒，循环1次；
[0131]PCR反应：95°C5 秒，58°C30 秒，循环 40 次；
[0132] 解离：95°C15 秒。
[0133] 一般认为，与对照组细胞相比，Ct值差异达到2以上即可认为存在显著差异，因此 找出与对照组Ct值差异最小但超过2的实验组，得到其稀释倍数，按照以下公式计算慢病 毒滴度：
[0134]T=RX20X103,其中，T为慢病毒滴度，T的单位为TU/mL，R为稀释倍数。
[0135] 经计算，本次包装的慢病毒滴度大于107TU/mL，表明此次慢病毒的包装是成功的。
[0136] 实施例6细胞转染、筛选与基因表达情况检测
[0137]在慢病毒液中加入IL-2(60IU/mL)和硫酸鱼精蛋白（10μg/mL)，然后与经抗⑶3 抗体（1μg/mL)和抗CD28 抗体（1μg/mL)的人JurkatT细胞（2. 5X105~5X10 5个）混 合均匀后，植入24孔板中，每孔2mL。在32°C下以lOOOg的速度对24孔板离心90min后， 置于37°C，5%C02培养24h，然后将培养基换成新鲜的完全培养基，再置于37°C，5%C0 2培 养48h。接着利用流式细胞术对TCRi3和捕获的gplOO四聚体进行检测，其结果如图3和图 4所示。
[0138] 有图3和图4可以看出，经慢病毒处理后的实验组JurkatT淋巴细胞，其TCR在细 胞表面的表达水平与未经处理的对照组均有显著提高，捕获gpl〇〇的比例也有显著升高， 说明pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual-Casp9.WPRE载体能很好地用于哺乳动物细胞双外源基因 的高效表达。
[0139] 实施例7人工诱导细胞凋亡
[0140] 取未经慢病毒处理的对照组细胞和经慢病毒处理的实验组细胞，分别设置不加二 聚化诱导剂（CID) (AP20187;ARIADPharmaceuticals,Cambridge,MA)和加入CID至终浓度 50nmol/L两组，置于 37°C，5% (：02下培养 24h。24h后，使用AnnexinV-PE和 7-AAD染色 后进行流式细胞术检测，观察细胞的凋亡和坏死情况，其结果如图5所示。
[0141] 由图5可以看出，未经CID处理的对照组和实验组细胞以及经CID处理的对照组 细胞的凋亡和坏死比例无显著差异，而经CID处理的实验组细胞的凋亡和坏死比例则高达 93%，显著高于其他组的细胞，说明借助CID和iCasp-9能人